許愛霞，薛冰，余躍華，吉麗

(江西省婦幼保健院檢驗科，江西 南昌330006)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性40歲前發(fā)生的卵巢功能衰竭，臨床表現(xiàn)為絕經(jīng),且伴有雌激素水平下降和促性腺激素水平上升的疾病。POF不但給婦女造成心理創(chuàng)傷，而且患者的低雌激素水平增加了患骨質(zhì)疏松癥和冠心病的危險[1,2]。POF的病因十分復(fù)雜，涉及到遺傳、免疫、病毒感染、醫(yī)源性及心理等因素，約30%的POF是由遺傳因素引起[3]，而約半數(shù)以上的POF患者找不到病因，稱為特發(fā)性POF，其中50%~60%可能與免疫因素有關(guān)[4,5]。近幾年卵泡發(fā)育相關(guān)基因在POF發(fā)病中的作用已有初步研究[6]。本實驗擬探討原癌基因c-erbB2和EGFR在卵巢早衰大鼠卵巢中的表達,為更深入了解卵巢早衰病因以及臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Sprague-Dawley(SD)雌性大白鼠,10周齡,健康,體重200～220g,由南昌大學醫(yī)學院動科部提供,合格證號為0319602。

1.1.2 主要試劑和儀器 c-erbB2多克隆抗體(北京博奧森公司)、EGFR多克隆抗體 (武漢博士德生物工程有限公司)；生物素標記的二抗 (北京中杉公司)；雷公藤多甙片(湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準字Z43020138)；人促卵泡生成激素放射免疫分析試劑盒、雌二醇放射免疫分析試劑盒、人促黃體生成激素放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；放射免疫檢測儀 (西門子 CENTAUR 5802)。

1.2方法

1.2.1 動物分組 大白鼠購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隔日換墊料,室溫控制在25℃,濕度70%,通風良好。其后連續(xù)10d進行陰道涂片，以觀察大鼠的動情周期，將有動情周期的20只大鼠納入實驗，并隨機分為對照組和實驗組，每組10只。實驗組:口服灌胃法，生理鹽水配制的雷公藤多甙片懸浮液按照50mg/Kg·d，共14d,造POF模型。 空白組:同劑量生理鹽水灌胃，1次/d，共14d；自灌藥第4d起，每日進行陰道涂片，觀察動情周期，每兩天測1次體重。

1.2.2 標本處理 給藥結(jié)束后24h,對照組和模型組大鼠給予10%水合氯醛麻醉后眶周取血標本，處死，留取卵巢。留取的血標本靜置后,離心,取上清液保存于低溫冰箱，待激素檢測。留取的卵巢置于中性福爾馬林液中固定,石蠟包埋,連續(xù)切片,貼附于預(yù)先用多聚賴氨酸處理好的載玻片上，37~42℃烤片過夜，以備HE染色和免疫組化用。

1.2.3 黃體生成激素、雌二醇和促卵泡生成激素均采用放射免疫法檢測，操作步驟和結(jié)果判斷嚴格按說明書進行。

1.2.4 免疫組化染色 切片脫蠟，0.3%H202處理，抗原熱修復(fù)后滴加封閉液，封閉后與EGFR或cerbB2多克隆抗體(1:200)孵育，4℃過夜，次日與生物素偶聯(lián)的二抗工作液，37℃孵育20 min，再與辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。同時設(shè)置PBS緩沖液代替一抗的空白對照。

1.2.5 卵泡發(fā)育觀察和組織學判斷標準 每個蠟塊取切片2張,每張切片觀察5個視野,每組共觀察計數(shù)40個高倍鏡視野下卵巢最大橫切面上的各級正常卵泡總數(shù)，最后取均數(shù)。組織學標準：初級卵泡為卵母細胞由單層立方狀顆粒細胞包圍；次級卵泡為卵母細胞由2層或2層以上的立方狀顆粒細胞包圍；成熟卵泡為卵泡發(fā)育的最后階段,出現(xiàn)大的卵泡腔。閉鎖卵泡為卵母細胞核固縮，染色體、胞質(zhì)溶解，顆粒細胞層減少。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSSl3.0版本軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，均數(shù)間的比較用t檢驗，以P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組性激素水平檢測結(jié)果 見表1。

表1 兩組大鼠血清性激素水平比較(±s)

表1 兩組大鼠血清性激素水平比較(±s)

注:與空白組比較*P<0.01。

組別 例數(shù) FSH(mIU/ml)LH(mIU/ml)123.586±41.239 64.972±32.684*E2(pg/ml)空白組實驗組10 10 1.639±0.715 1.639±0.715*2.586±0.893 4.524±1.871*

2.2 兩組卵巢組織形態(tài)學觀察 空白組卵巢卵泡生長活躍,可見較多的成熟和次級卵泡,較少閉鎖卵泡，顆粒細胞層次多；實驗組卵巢次級卵泡和成熟卵泡明顯減少(P<0.01)，可見較多閉鎖卵泡(P<0.01)，卵泡的顆粒細胞層次明顯減少。見圖1,表2。

表2 兩組大鼠各級卵泡的構(gòu)成(40個高倍視野)

圖1培養(yǎng)前后的新生太鼠卵巢組織切片HE染色結(jié)果(×400)

2.3 ErbB2蛋白和EGFR蛋白在卵泡中的表達定位 用免疫組化SP方法檢測不同組別的卵巢內(nèi)ErbB2蛋白和EGFR蛋白的表達，結(jié)果顯示，空白組ErbB2蛋白和EGFR蛋白陽性信號明顯，主要位于卵母細胞胞膜上，為深棕色染色顆粒，實驗組則陽性表達極少。見圖2。

圖2 ErbB2蛋白和EGFR蛋白在卵泡中的表達(SP×400)

3 討論

POF近年來發(fā)病率不斷升高，研究顯示其在40、30、20歲以前的婦女中發(fā)病率分別為1%~2%、0.1%、0.01%[7,8],且有進一步年輕化的趨勢。POF易導(dǎo)致生育力喪失及雌激素水平低下，由于病因未明，治療效果不佳，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和身心健康。研究表明，POF發(fā)病的主要機制很可能是卵泡發(fā)育及成熟障礙[9]。由于卵巢卵泡發(fā)育需眾多基因和信號通路參與，并通過多種途徑相互協(xié)調(diào)作用，因此任何導(dǎo)致始基卵泡池縮小、卵泡耗竭加速、卵泡募集或功能異常的因素，均可發(fā)生卵巢早衰。近年研究表明POF基因調(diào)控可能與原癌基因有關(guān)[10，11]。

原癌基因是一類細胞內(nèi)高度保守的正?；?這類基因在正常細胞中的表達嚴格受時間、空間、程序的調(diào)控，通過其表達產(chǎn)物-蛋白質(zhì)分子調(diào)節(jié)不同組織細胞增殖及分化。原癌基因c-erbB2屬于孤兒受體，尚無特異性配體，但同樣具有酪氨酸激酶活性，參與信號傳導(dǎo)系統(tǒng)和細胞生長的調(diào)節(jié)。表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因c-erbBl所編碼的跨膜糖蛋白，當EGFR和配體EGF結(jié)合后，催化多種底物酪氨酸殘基磷酸化，可啟動、催化與細胞生長增殖有關(guān)的生長過程。我們以往研究發(fā)現(xiàn)在原始卵泡啟動生長過程中有c-erbB2 mRNA的表達，且隨著卵泡發(fā)育逐漸增加，而且EGF可以上調(diào)c-erbB2 mRNA的表達，表明原癌基因c-erbB2在原始卵泡啟動生長中起重要的促進作用[12,13]。本實驗HE染色發(fā)現(xiàn)空白組卵巢卵泡生長活躍,可見較多的成熟和次級卵泡,顆粒細胞層次多，而早衰卵巢內(nèi)極少次級卵泡和成熟卵泡(P<0.01)，可見較多閉鎖卵泡(P<0.01)，卵泡的顆粒細胞層次明顯減少，與文獻結(jié)果一致[14,15]。免疫組化發(fā)現(xiàn)空白組ErbB2蛋白和EGFR蛋白陽性信號明顯，主要位于卵母細胞胞膜上，為深棕色染色顆粒，實驗組早衰卵巢則陽性表達極少。結(jié)果提示c-erbB2基因和EGFR可能參與了卵巢早衰中的卵泡成熟障礙及卵泡凋亡調(diào)控，但c-erbB2基因和EGFR具體通過何種途徑影響早衰卵巢中卵泡的發(fā)育，還需進一步研究。

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