劉志強，柯江維，樂萍，段榮

(江西省兒童醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006)

近幾年,隨著多藥聯(lián)合強化治療的實施，兒童急性淋巴細胞白血病 (acute lymphoblastic leukaemia,ALL)的長期無病存活率明顯提高,部分發(fā)達國家已達90%[1],但仍有患兒復發(fā)死亡。如何防止復發(fā)、避免不必要的過度化療一直是兒科血液腫瘤研究者期待解決的問題。近年來大量相關研究提出,ALL復發(fā)的主要原因之一是白血病誘導化療完全緩解后,在體內殘留微量白血病細胞,即微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)[2]。 目前適合MRD檢測的方法只有聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)和流式細胞術(flow cytometry，FCM)[3]。本研究應用實時定量PCR(realtime quantitative PCR，RQ-PCR),對 153例 ALL患兒化療前、誘導化療結束及強化治療末期骨髓樣本的MRD進行監(jiān)測,以評估其在預測復發(fā)、指導個體化治療方面的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2010年3月-2014年6月期間江西省兒童醫(yī)院血液科病房收治的376例急性淋巴細胞白血病患兒資料，其中男151例，女225例，中位年齡5.4歲(1.6月～14歲)。所有患兒均經細胞形態(tài)學-免疫學-細胞遺傳學-分子遺傳學(MICM)進行診斷及分型。從誘導化療結束為完全緩解后開始列入隨訪，平均隨訪時間28月(10～41月)。

1.2 治療方案 按2006年中華醫(yī)學會兒科學分會血液學組兒童ALL診療建議(第三次修訂草案)[4]及2010年全國兒童ALL臨床路徑方案進行治療。以誘導化療結束骨髓涂片檢查時原幼淋巴細胞＜5%為骨髓完全緩解?；熐熬颜鞯没純杭覍俚闹橥?。

1.3 標本采集 分別于治療前、誘導化療結束后、強化治療后抽取骨髓肝素抗凝標本2ml。

1.4 融合基因檢測

1.4.1 總RNA提取 將抽取的骨髓標本經Ficoll Hypaque淋巴細胞分離液密度梯度離心分離單個核細胞。用RNA Isolation Kit(Promega SV Total RNA Isolation System購自美國Promega公司)提取總RNA。

1.4.2 cDNA合成 反轉錄的反應體系(試劑購自大連寶生物有限責任公司):(1)5×Prime ScriptTMBuffer(for Real Time)2μl;(2)Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ0.5μl;(3)Oligo(dT)Primer(50μmol·L-1)0.5μl;(4)Random 6 mers(100μmol·L-1)2μl;(5)Total RNA 1μg;(6)RNase Free雙蒸水 (dH2O)補充至反應體系10μl。 反應條件:37℃ 15 min，85 ℃ 5s。cDNA 產物置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 引物設計和合成 各融合基因及ABL內參基因的引物及探針均選用歐洲抗癌項目組公布的序列。引物及探針均由大連寶生物工程有限公司合成。各融合基因的引物序列見表1。

1.4.4 qRT-PCR反應實驗采用TaqMan探針法，在熒光定量PCR儀(ABI PRISM 7500)上檢測，同時擴增內參ABL，每個標本做2個復孔。定量PCR反應體系采用 “白血病相關融合基因檢測試劑盒(ALL 9種)(核酸擴增熒光定量法)(上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司)。

表1 RQ-PCR引物序列

2 結果

2.1 TEL/AML1、BCR/ABL、E2A/PBX1、MLL/AF4 四種融合基因的檢測 所有標本均經RQ-PCR檢測，每例標本最多只存在1種異常融合基因。376例ALL患兒中融合基因陽性共153例，其中TEL/AML1陽性 91例 (24.2%)，BCR/ABL陽性 26例(6.9%)，E2A/PBX1 陽性 27(7.2%)，MLL/AF4 陽性 9(2.4%)。

2.2 治療反應及療效觀察 在不同時期對融合基因陽性兒童進行監(jiān)測，詳見表2。TEL/AML1陽性組誘導化療結束有13(14.3%)例融合基因未轉陰，強化治療末仍有2(2.2%)例融合基因未轉陰，隨訪期間無復發(fā)；BCR/ABL陽性組誘導化療結束有19(73.1%)例融合基因未轉陰，強化治療末仍有9(34.6%)例融合基因未轉陰，隨訪中有5例(19.2%)復發(fā)，2(7.7%)例死亡；E2A/PBX1陽性組誘導化療結束有8(29.6%)例融合基因未轉陰，強化治療期末仍有4(14.8%)例融合基因未轉陰，隨訪中1例(3.7%)復發(fā)；MLL/AF4陽性組誘導化療結束有6(66.7%)例融合基因未轉陰，強化治療末仍有3(33.3%)例融合基因未轉陰，隨訪中有2例(22.2%)復發(fā)，1(11.1%)例死亡。見表2。

3 討論

MRD是指白血病患者經誘導緩解治療達到臨床緩解后，其體內殘存的用形態(tài)學方法無法檢出的微量白血病細胞，這些殘存的白血病細胞是患者復發(fā)的根源[5]。MRD檢測有較高的敏感性，為治療效果的評估提供了更加直接、客觀的依據。目前以MRD風險評估為基礎的治療方案的臨床試驗表明，以MRD為指導的治療可能成為今后ALL的治療標準[6]。

以PCR方法檢測白血病融合基因是目前常用的MRD檢測方法，敏感度可達10-6數量級。以融合基因作為標志物的優(yōu)點是初發(fā)時所檢測到的融合基因在治療過程中不會發(fā)生進一步的改變，可以在不同時間點進行監(jiān)測[7]。TEL/AML1、BCR/ABL、E2A/PBX1、MLL/AF4 是 ALL 中最常見的四種融合基因，已經成為兒童ALL從診斷到治療的常用的檢測項目。

表2 各組患兒的治療反應

急性淋巴細胞白血病患兒體內t(12;21)染色體結構異常,將導致12p12的TEL基因與21q22的AML基因發(fā)生融合,最終形成TEL-AML1融合基因。TEL-AML1是兒童ALL中最常見的融合基因。在我院兒童ALL的樣本研究中，TEL-AML1融合基因陽性患兒占24.2%，這與其他研究中心的結果接近[8]。大多數研究認為，TEL/AML1陽性是兒童ALL預后好的標志[9]，史利歡等[10]最近的研究指出，TEL／AML1陽性兒童ALL臨床總有效率高于TEL/AML1陰性兒童ALL。本研究中發(fā)現大多數TEL/AML1陽性患兒對化療敏感度高，CR期長，前期隨訪無復發(fā)。

9號染色體和22號染色體易位形成的BCR/ABL融合基因是慢性髓系白血病的特征性標志，在兒童ALL中的陽性僅有3%～5%[11]，我院兒童ALL的樣本研究中，BCR/ABL融合基因陽性患兒占6.9%，比例偏高，與Na等[12]相近。BCR/ABL融合基因陽性ALL是一類高度異質惡性疾病，該類疾病容易合并中樞神經系統(tǒng)白血病，緩解率低，復發(fā)率高，預后極差，BCR/ABL融合基因陽性的ALL患者中位生存期為6～10個月[13]。本研究中BCR/ABL融合基因陽性患兒在誘導化療結束有73.1%未轉陰，強化治療末仍有34.6%未轉陰，且隨訪中有19.2%的患兒復發(fā)，7.7%的患兒死亡，與文獻報道相符。

兒童ALL中t(1;19)(q23;p13)易位，即19p13的E2A和1q23上的PBX1易位融合，形成E2A/PBX1融合基因，比例約為5%[14]。在我院兒童ALL的樣本研究中，E2A/PBX1融合基因陽性患兒占7.1%，比文獻偏高，可能是樣本量偏少所致。已往認為，該融合基因陽性ALL患兒對化療的反應差，且預后不佳，近年來通過對化療強度的提高，預后得到了明顯改善[15]，本研究亦證實E2A/PBX1融合基因陽性患兒化療敏感性較高，早期復發(fā)率低。

混合譜系白血病MLL基因位于11q23，MLL基因重排是造血系統(tǒng)惡性腫瘤中常見的遺傳學改變，在兒童ALL中發(fā)生率約為 6%[16]，目前發(fā)現MLL基因易位重排類型有60多種，其最常見的是MLL/AF4。過去研究發(fā)現此類ALL大多惡性程度高，常規(guī)化療反應差，生存期短[17]，孫豫蘭等[18]研究發(fā)現，MLL-AF4融合基因陽性患兒完全緩解率和5年EFS都顯著低于非MLL-AF4患兒。本研究亦證實MLL-AF4融合基因陽性患兒化療敏感性低，早期復發(fā)率高22.2%。

遺傳學異常在兒童ALL中有很強的預后因素。不同類型白血病可有不同的融合基因，同一種類型白血病具有不同的融合基因，其療效和預后亦不相同。實時熒光定量PCR技術可以有效地檢測出白血病常見融合基因并進行定量分析，為指導治療、判斷預后提供重要依據，尤其是檢測MRD水平的應用，對臨床白血病患者的個體化治療發(fā)揮越來越重要的作用。隨著全基因組掃描技術的廣泛應用，將可能為MRD檢測發(fā)現更多的遺傳標志，服務于臨床。此外，近十年提出殘留的白血病干細胞(leukemia stem cells,LSCs)是疾病復發(fā)的根源[19]，分子生物學技術在白血病化療后監(jiān)測中的運用將更為廣泛，地位將更為突出。

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