楊軍平，田昌隆

(江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南 昌330006)

目前原發(fā)性非小細胞肺癌是我國城市當中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1，2]。該病病因至今尚未完全明確，目前認為吸煙是其最重要的高危因素，由于煙草中多鏈芳香烴類化合物和亞硝胺可通過多種機制導致支氣管上皮細胞DNA損傷，使得癌基因激活和抑癌基因失活或表達下降從而導致細胞分裂失控，細胞粘附性下降，最終癌變，因此研究細胞粘附因子對攻克腫瘤細胞的轉移和浸潤具有重要的意義。 已有研究表明，T-cadherin表達的下調(diào)與肝癌、結腸癌、宮頸癌和鼻咽癌的發(fā)生和轉移有關[3-7]，但是該基因的表達下調(diào)是否與非小細胞肺癌的發(fā)生和轉移有關尚無定論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源 本實驗選用非小細胞肺癌組織標本50例全部來自于2011年6月至2013年9月在江西省中醫(yī)院胸外科進行非小細胞肺癌根治術的患者。術后將腫瘤及周邊組織石蠟包埋。

1.1.2 臨床資料 實驗組非小細胞肺癌標本50例，組織標本全部來自于江西省中醫(yī)院胸外科非小細胞肺癌患者手術切除的標本，所有患者術前均未接受過放療或化療，手術患者均病理診斷為非小細胞肺癌，按組織學分型為鱗狀細胞癌占32例，腺癌16例，腺鱗癌2例，男性39例，女性11例，患者年齡分布從42.5歲至73.2歲，平均年齡61.4歲。標本取自肉眼可見腫瘤區(qū)(未壞死)。

非小細胞肺癌的腫瘤病理分期標準:結合有關腫瘤、附近淋巴結和遠處器官轉移的信息，而分期用來指特定的TNM分組。分組分期使用數(shù)字0和羅馬數(shù)字ⅠⅡⅢⅣ來描述。T代表腫瘤(其大小以及在肺內(nèi)和鄰近器官的擴散程度)，N代表淋巴結擴散，M表示轉移(擴散到遠處器官)。對照組(1)癌旁正常肺組織50例，取距離同一實驗組腫瘤組織邊緣5cm以上的遠癌正常肺組織為對照。對照組(2)良性病變肺組織20例，組織標本取自江西省中醫(yī)院胸外科2011年6月至2013年9月間8例肺結核球、10例支氣管擴張、2例肺錯構瘤患者手術切除的肺組織。

1.1.3 主要試劑 兔抗人T-cadherin多克隆抗體(I抗)，購自美國 eBioscience公司。DAB顯色試劑盒購自于上海波谷生物科技有限公司；羊抗兔Ⅱ抗、0.1 M 磷酸鈉、0.25 M NaCl(pH7.6)和 15 mg/ml BSA購自生興生物技術(南京)有限公司。即用型免疫組化S-P試劑盒購自于上海倍尼菲生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查、收集臨床資料 查閱病歷，收集患者年齡、腫瘤大小、組織類型、組織分級、臨床分期、淋巴結轉移情況等全部資料并錄入SPSS19.O軟件數(shù)據(jù)庫。所有標本切片請江西省中醫(yī)院病理科有經(jīng)驗的主任醫(yī)師指導復查。

1.2.2 按常規(guī)方法進行玻片處理及切片制備。

1.2.3 實驗方法 組織切片按常規(guī)方法進行脫蠟水化后，用0.03%H2O2在室溫條件下處理15～30 min，以封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性，然后通過煮沸法進行抗原修復，再采用兔抗人T-cadherin多克隆抗體為一抗進行免疫組織化學染色，具體方法如下：先滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育10min，甩去多余液體，滴加預稀釋I抗(兔抗人T-cadherin多克隆抗體，工作濃度1:100)50μl，將組織切片放入4℃冰箱中保存過夜(PBS液替代I抗作陰性對照)，取出組織切片37℃下復溫30min，用PBS液沖洗5min，重復3次，擦干組織周圍殘留的PBS液后，再滴加生物素標記的Ⅱ抗，室溫靜置1h，PBS液沖洗5min，重復3次，滴加HRP標記鏈親和素(辣根酶標記的鏈霉卵白素)，室溫靜置15min，PBS液沖洗5min，重復3次，擦干殘留的PBS，最后在暗室中取1ml去離子水，分別滴加DAB顯色試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后立即滴加切片，置暗盒中室溫下顯色，顯微鏡下控制顯色反應時間約3min，蒸餾水終止反應，用自來水充分沖洗10min后，蘇木精復染1min，流水沖洗返藍2 min，0.5%鹽酸酒精分化2s，流水沖洗2min，遞升梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.4 結果判定 T-cadherin的免疫組化染色以細胞膜及胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者為陽性染色。評分標準參照Bames[8]等提出的基于3個參數(shù)的半定量計數(shù)方法，即染色強度、陽性細胞數(shù)和兩者記分的乘積。染色強度計分標準為:無色為0分，淺黃色為1分，中度著色為2分，深棕黃色為3分。陽性細胞數(shù)目計分標準為:100倍光鏡下任意選取10個視野，200倍光鏡下觀察每一視野，連續(xù)觀察計數(shù)100個細胞，記錄其中陽性細胞數(shù)，根據(jù)陽性細胞所占百分比進行評分，計算陽性細胞百分數(shù)后從0到4評分:0分:＜10%陽性細胞數(shù);1分:11%~30%陽性細胞數(shù);2分:31%~50%陽性細胞數(shù);3分:51%~75%陽性細胞數(shù);4分:＞76%陽性細胞數(shù)。兩者相乘計分之積為最后得分:0分為(-)，1~2分為(+)，3~4 分為(++)，大于 4 分為(+++)。評分(-)和(+)視為T-cadherin陰性表達，(++)和(+++)視為 T-cadherin陽性表達。如在同一標本中存在多個不同評分的視野，則取最大值和最小值的平均值做為免疫組化評分。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行分析處理，組間陽性率的比較及陽性率與臨床病理特征之間的相關性分析用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T-cadherin在非小細胞肺癌組織、癌周組織和良性病變肺組織中的表達 在50例非小細胞肺癌組織標本中，T-cadherin陽性表達率為20%(10/50),對照組1含50例癌周組織標本，T-cadherin陽性表達率為62%(31/50)，對照組2含20例良性病變標本，T-cadherin陽性表達率為65%(13/20)(見表1)，非小細胞肺癌組織、癌周5cm外的正常肺組織及良性肺腫瘤組織率差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。T-cadherin在非小細胞肺癌組織中的細胞免疫組化染色后的鏡下形態(tài)見圖1所示。

圖1 T-cadherin在非小細胞肺癌組織中的表達(免疫組化染色結果，左圖為陰性，右圖為陽性，×200倍視野)

表1 T-cadherin在非小細胞肺癌組織、癌周組織和良性病變肺組織中的表達情況(%)

2.2 T-cadherin基因在有無肺門和/或縱膈淋巴結轉移的非小細胞肺癌組織中的表達 表2所示為按有無淋巴結轉移(肺門和/或縱膈淋巴結)來分析T-cadherin的表達情況，其中有淋巴結轉移的非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率為4.17%，而無淋巴結轉移的非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率為34.6%。經(jīng)χ2檢驗，有淋巴結轉移的非小細胞肺癌組織與無淋巴結轉移的非小細胞肺癌組T-cadherin陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 T-cadherin基因在有無肺門和/或縱膈淋巴轉移非小細胞肺癌組織中的表達情況

2.3 基于臨床病理特性分型的T-cadherin的表達表3所示為按照TNM分期來分析，TNM分期I期非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率為70%，TNM分期Ⅱ期非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率為10.5%，TNM分期Ⅲ及IV期非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率為4.76%。兩兩比較，TNM分期I期非小細胞肺癌組織與TNM分期Ⅱ期非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。TNM分期Ⅱ期非小細胞肺癌組織與TNM分期Ⅲ及IV期非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表3 T-cadherin基因在各TNM分期的非小細胞肺癌組織中表達情況

2.4 T-cadherin基因在不同分化程度的非小細胞肺癌組織中的表達 表4所示為按腫瘤組織分化程度來分析，將其分高中分化組和低分化組。高中分化的非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率為19.23%，而低分化的非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率為20.83%。經(jīng)χ2檢驗，高中分化的非小細胞肺癌組織與低分化的非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表4 T-cadherin基因在不同分化程度的非小細胞肺癌組織中表達情況

2.5 T-cadherin基因在各組織學分型的非小細胞肺癌組織中的表達 表5所示為按病理學分類分析，由于鱗腺癌樣本只有兩例，且無陽性表達，統(tǒng)計誤差可能過大，暫不將鱗腺癌做統(tǒng)計學分析，鱗狀細胞癌組織中T-cadherin分子陽性表達率為9.38%(3/32)，而腺癌組織中T-cadherin分子陽性表達率為43.75%(7/16)。經(jīng)χ2檢驗，鱗狀細胞癌與腺癌中T-cadherin分子陽性表達有統(tǒng)計學差異 (P<0.05)。

3 討論

細胞黏附分子(Cell adhesion molecule，CAM)是介導細胞與細胞或細胞與細胞外基質(zhì)相互接觸和結合的一類糖蛋白分子[9-11]，Cadherin家族成員主要包括 E-cadherin、N-cadherin、P-cadherin、T-cadherin[12，13]。正常細胞在cell adherin的作用下發(fā)生黏附，從而不易脫落和轉移，但當Cadherin表達下降時，細胞的黏附力會下降，從而導致細胞的移動[14-16]。T-cadherin表達的下調(diào)與腫瘤的發(fā)生已經(jīng)被廣泛的接受了，但是T-cadherin表達的下調(diào)是否與非小細胞肺癌的發(fā)生和轉移有關尚無定論。本研究探討了非小細胞肺癌組織、癌周組織和良性病變肺組織中T-cadherin表達水平，并從有無淋巴結轉移，TNM分期，病理學分類及分化程度四個因素來分別討論，以期發(fā)現(xiàn)T-cadherin在非小細胞肺癌患者中的表達及其惡性生物學特征關系。

表5 T-cadherin基因在各組織學分型的非小細胞肺癌組織中表達情況

從本研究中可以看到，非小細胞肺癌組織、癌周5cm外的正常肺組織、肺結核球、支氣管擴張、錯構瘤肺組織中的T-cadherin表達情況，發(fā)現(xiàn)正常肺組織、癌周組織、肺結核球、支氣管擴張、錯構瘤肺組織中絕大多數(shù)細胞均呈強陽性或陽性染色，細胞漿內(nèi)不染色，而在肺腺癌組織中腫瘤細胞呈黃色到棕黃色染色，且染色數(shù)量較前明顯減少。非小細胞肺癌組織、癌周5cm外的正常肺組織及良性肺腫瘤組織率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。我們推論腫瘤組織與癌周正常組織中T-cadherin表達的顯著差別，可能與兩者間細胞轉移能力差別存在一定的相關性。T-cadherin分子是細胞外的黏蛋白分子，其水平下降可以導致細胞黏附力下降，從而細胞移動、轉移能力增強。這與以往相關研究結果相似。

非小細胞肺癌組織與良性肺病變組織中的T-cadherin陽性表達率具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。良性病變與惡性腫瘤間最重要的差異是轉移能力，我們推測T-cadherin表達的下降與腫瘤細胞的惡變存在密切聯(lián)系。

良性肺病變組織中及癌周正常組織中T-cadherin表達則基本相似，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，由此推論由于癌周組織和良性病變組織細胞轉移能力弱，而肺腫瘤細胞有明顯的遷移能力，而T-cadherin分子正是細胞黏附分子的一員，其表達的下降導致腫瘤細胞遷移能力增強，而在非腫瘤細胞中則無這種情況。

本研究還揭示了T-cadherin在有無淋巴結轉移的表達差異。無淋巴結轉移的腫瘤細胞之間可能通過T-cadherin的作用而發(fā)生黏附,不易脫落,而有肺門淋巴結轉移或縱膈淋巴結轉移的腫瘤細胞T-cadherin表達下降，因細胞間的黏附力減弱,易引起腫瘤細胞沿淋巴管轉移到附近淋巴結。T-cadherin表達下降，使腫瘤細胞黏附性下降，細胞遷移能力增強，因此更容易出現(xiàn)淋巴結轉移。

T-cadherin與腫瘤的發(fā)生、轉移有著密切的聯(lián)系，可能扮演抑癌基因的角色。從實驗中我們可以看到，TNM分期I期非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達率最高，I期非小細胞肺癌沒有肺內(nèi)轉移及肺外轉移，Ⅱ期非小細胞肺癌侵犯臟層胸膜或者出現(xiàn)轉移到同側支氣管周圍或同側肺門和肺動脈淋巴結，其細胞T-cadherin陽性表達率已經(jīng)有明顯下降，而TNM分期Ⅲ及IV期非小細胞肺癌已經(jīng)有明顯轉移灶出現(xiàn)，推測T-cadherin表達下降，使腫瘤細胞黏附性下降，細胞遷移能力增強，因此更容易發(fā)生轉移。

按腫瘤組織分化程度來分析，高分化的非小細胞肺癌組織與低分化的非小細胞肺癌組織中T-cadherin陽性表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。就實驗結果來看，鱗癌與腺癌中的分化高低與T-cadherin陽性表達率無相關性。按病理學分類分析，鱗癌與腺癌組織中T-cadherin陽性表達有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。我們推測這與鱗癌細胞間有橋粒聯(lián)接，張力微絲附著有關。鱗癌其生長速度較慢，因此轉移較晚。而腺癌出現(xiàn)轉移則較早出現(xiàn)。

綜上所述，在非小細胞肺癌患者中，T-cadherin的表達與腫瘤的發(fā)生和轉移呈負相關性。非小細胞肺癌組織中T-cadherin表達下調(diào)與腫瘤TNM分期以及淋巴結轉移有相關性。腺癌發(fā)生與T-cadherin表達下調(diào)存在相關性。

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