鄒 云， 余資江， 林金棠

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

大鼠脊髓半橫斷損傷后S-100B表達(dá)的變化*

鄒 云， 余資江**， 林金棠

(貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

目的： 研究大鼠脊髓半橫斷損傷(SCI)后損傷區(qū)域星形膠質(zhì)源性蛋白(S-100B)的表達(dá)情況。方法： 將70只雄性成年SD大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)、假手術(shù)組(10只)及模型組(行T10脊髓右側(cè)半切術(shù)，術(shù)后分為1 d，7 d，14 d，21 d，28 d組，每組各10只)；術(shù)后于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采用BBB及Reuter法行后肢神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分后處死大鼠，對(duì)SCI后損傷區(qū)域行S-100B免疫組織化學(xué)染色，Western blot檢測(cè)S-100B蛋白表達(dá)，透射電鏡觀察損傷區(qū)域的組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果： (1)BBB與Reuter評(píng)分顯示模型組大鼠麻醉清醒后即出現(xiàn)癱瘓及感覺功能障礙，術(shù)后7 d神經(jīng)功能開始好轉(zhuǎn)，隨著時(shí)間的推移，神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)，14 d時(shí)后肢神經(jīng)功能恢復(fù)最明顯；(2)免疫組織化學(xué)顯示正常組及假手術(shù)組少量表達(dá)S-100B，模型組S-100B表達(dá)較正常組及假手術(shù)組均增高，S-100B表達(dá)在14 d時(shí)達(dá)到高峰，大量反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大，28 d時(shí)S-100B表達(dá)趨于穩(wěn)定；(3)Western blot檢測(cè)S-100B蛋白表達(dá)水平與免疫組織化學(xué)結(jié)果相一致；(4)電鏡下SCI后損傷區(qū)域神經(jīng)元腫脹，變性，細(xì)胞器減少，線粒體水腫，空泡變性。結(jié)論： SCI后S-100B表達(dá)增高，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，可能與損傷神經(jīng)的自發(fā)修復(fù)過程有關(guān)。

脊髓損傷; 修復(fù)； 神經(jīng)再生； 星形膠質(zhì)源性蛋白； 大鼠,Sprague-Dawley

星形膠質(zhì)源性蛋白(S-100B)是一種酸性的能與鈣、鋅結(jié)合的可溶性蛋白，屬于鈣結(jié)合蛋白家族[1]。S-100B除在細(xì)胞內(nèi)存在外，也可被星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，發(fā)揮重要的生理功能，亦作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性蛋白受到廣泛重視[2]。脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)時(shí)，損傷和壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放大量S-100B，損傷刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞活化也可產(chǎn)生S-100B[3-4]，其濃度的變化或可間接反映神經(jīng)損傷的病理生理過程。本實(shí)驗(yàn)主要研究S-100B與SCI時(shí)損傷恢復(fù)時(shí)間的變化規(guī)律，為治療神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

兔抗S-100B多克隆抗體、即用型SABC顯色試劑盒、生物素化二抗(羊抗兔IgG)及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物公司，細(xì)胞裂解液(RIPA)、5×蛋白上樣緩沖液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，四甲基乙二胺(TEMED，北京索萊寶生物科技有限公司)，蛋白電泳儀(PowerPae Basic Power supply型) 、垂直電泳槽(Mini-PRoTEAN3型)、轉(zhuǎn)移電泳槽(Mini Tans-Blot Cell型) 購(gòu)于美國(guó)Bio-RAD公司，RM2016輪轉(zhuǎn)切片機(jī)購(gòu)于上海徠卡儀器有限公司，自備常規(guī)手術(shù)器械等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及手術(shù)方法 選擇健康成年雄性SD大鼠70只，體重250～300 g，隨機(jī)分為正常組(10只，常規(guī)飼養(yǎng))、假手術(shù)組(10只，摘除棘突和椎板，不損傷脊髓)及模型組(行T10脊髓右側(cè)半切術(shù)，術(shù)后分為1 d，7 d，14 d，21 d，28 d組，每組各10只)。T10脊髓右側(cè)半切術(shù)：麻醉后常規(guī)消毒鋪巾，俯臥位固定大鼠，定位T10棘突。切開T9～T11皮膚，分離兩側(cè)棘突旁肌肉，暴露T9～T11棘突和椎板，固定T10椎板，小號(hào)持針器仔細(xì)摘除T10棘突、右側(cè)椎板至右側(cè)關(guān)節(jié)突，充分暴露手術(shù)所需視野，而后定位中線，將尖刀片刀背對(duì)著正中溝，刀鋒向右向脊髓內(nèi)垂直刺入，隨即在與脊髓垂直方向向右側(cè)橫行切斷右半側(cè)脊髓；仔細(xì)止血，青霉素沖洗切口，逐層縫合。假手術(shù)組只摘除棘突和椎板，正常組常規(guī)分籠飼養(yǎng)。

1.2.2 大鼠后肢神經(jīng)功能評(píng)分 采用BBB[5]法行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，Reuter[6]法行感覺功能評(píng)分，觀察SCI后后肢功能恢復(fù)情況。BBB評(píng)分是根據(jù)動(dòng)物髖、膝、踝、趾、前后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)等情況評(píng)定運(yùn)動(dòng)功能，分22級(jí)，最高21分，最低0分。Reuter評(píng)分法是從牽張反射、疼痛回縮反射、背部感覺、肌張力及肌力等5個(gè)方面來評(píng)定SCI后的感覺變化，最低0分，表示正常，最高11分，表示癱瘓。評(píng)分采用雙盲、雙人獨(dú)立觀察記錄，最后取平均值。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)S-100B表達(dá) 各組取3只大鼠脊髓石蠟包埋后，按照試劑盒說明書檢測(cè)S-100B表達(dá)，隨機(jī)選取6個(gè)200倍視野,記錄SCI后不同時(shí)間點(diǎn)S-100B平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。免疫組化步驟簡(jiǎn)述如下：3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶(室溫，10 min)，5%正常山羊血清封閉(37 ℃，20 min)，滴加一抗(S-100B 1∶100)，4 ℃過夜(PBS代替一抗做陰性對(duì)照)，次日PBS浸洗3×2 min，滴加二抗(37 ℃，20 min)，SABC反應(yīng)(37 ℃，20 min)，DAB顯色、脫水、透明、封片。

1.2.4 Western blot檢測(cè)S-100B表達(dá) 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)取5只大鼠，用乙醚麻醉后在冰上迅速解剖出脊髓，切取以損傷區(qū)域?yàn)橹行募s3 cm長(zhǎng)度的脊髓節(jié)段，標(biāo)記后投入液氮中保存?？焖賹⒁旱械慕M織取出，放到研缽中研碎，加入RIPA裂解細(xì)胞，離心后分離提取蛋白行Western blot檢測(cè)，使用Quantity One對(duì)所做實(shí)驗(yàn)圖片進(jìn)行灰度值的定量分析。

1.2.5 超微結(jié)構(gòu)觀察 在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)取2只大鼠，麻醉、灌注后，快速取出損傷脊髓中心1 mm×1 mm×1 mm大小標(biāo)本，放入2%戊二醛中固定24 h(4 ℃)，透射電鏡觀察并攝片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠后肢神經(jīng)功能評(píng)分

模型組大鼠麻醉清醒后即出現(xiàn)癱瘓癥狀，感覺功能明顯異常，術(shù)后7 d傷側(cè)后肢神經(jīng)功能開始好轉(zhuǎn)，隨著時(shí)間的推移，大鼠后肢功能逐漸恢復(fù)，術(shù)后14 d時(shí)恢復(fù)最明顯，BBB評(píng)分達(dá)8分，Reuter評(píng)分恢復(fù)至5分以下，見表1。

2.2 S-100B陽(yáng)性細(xì)胞及蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，正常脊髓切片中S-100B陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，染成棕褐色；模型組術(shù)后1 d組，S-100B陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量開始增加，主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)；7 d組脊髓損傷標(biāo)本中 S-100B陽(yáng)性細(xì)胞胞體增大，突起增多，染色加深， 14 d組脊髓損傷標(biāo)本中這種表現(xiàn)更加明顯，21～28 d組，S-100B陽(yáng)性細(xì)胞與14 d比較未見明顯變化，見圖1。平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量見表2。脊髓損傷后S-100B蛋白的相對(duì)表達(dá)量較正常組及假手術(shù)組皆升高，術(shù)后14 d組升高最明顯，術(shù)后21～28 d組S-100B表達(dá)趨于穩(wěn)定，見圖2及表2。

組別BBBReuter正常組21.0±0.00 0±0.00假手術(shù)組19.0±0.81 0.5±0.54術(shù)后1d組 0.0±0.00(1)(2) 10.9±0.54(1)(2) 7d組 3.4±0.51(1)(2) 6.7±0.55(1)(2) 14d組7.8±0.54(1) 4.8±0.21(1)(2) 21d組10.2±0.84(1) 3.7±0.47(1) 28d組12.6±0.55(1) 3.3±0.40(1)

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與術(shù)后28 d組比較，P<0.05

注：a為正常組，b為術(shù)后1 d組，c為術(shù)后7 d組，d為術(shù)后14 d組，e為術(shù)后21 d組，f為術(shù)后28 d組

圖2 各組大鼠S-100 蛋白表達(dá)

2.3 透射電鏡觀察

電鏡下，正常脊髓切片中神經(jīng)元胞膜完整，細(xì)胞器豐富，線粒體結(jié)構(gòu)正常，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，核仁清晰；模型組術(shù)后1 d組，神經(jīng)元腫脹，細(xì)胞器減少，線粒體水腫，胞核固縮，核膜內(nèi)褶，染色質(zhì)分布不均；7 d組神經(jīng)元、線粒體腫脹，核膜內(nèi)褶明顯，核仁移向核膜；14 d組神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器丟失，線粒體腫脹明顯，嵴間隙增寬；21～28 d組脊髓神經(jīng)元線粒體腫脹，空泡變性。見圖3。

組別檢測(cè)指標(biāo)S-100B陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) S-100B蛋白相對(duì)表達(dá)量正常組5.6±0.550.45±0.013假手術(shù)組5.4±0.540.45±0.015術(shù)后1d9.0±0.71(2)0.59±0.013(2) 7d14.2±0.84(1)(2)0.77±0.018(1)(2) 14d23.2±0.84(1)1.25±0.036(1) 21d22.2±0.83(1)1.15±0.037(1) 28d22.0±0.70(1)1.06±0.028(1)

(1)與正常組比較，P<0.05；(2)與術(shù)后14 d比較，P<0.05

3 討論

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，其活動(dòng)受大腦的控制，具有重要的傳導(dǎo)功能，除了頭面部以外，來自軀干和四肢的淺、深部感覺以及大部分內(nèi)臟感覺，都是通過脊髓白質(zhì)的感覺纖維束傳達(dá)到腦，進(jìn)行高級(jí)綜合分析；大腦對(duì)軀干和四肢的骨骼肌運(yùn)動(dòng)以及內(nèi)臟(部分)的管理，通過脊髓白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)纖維束來完成。脊髓本身亦可完成許多反射活動(dòng)，同時(shí)也是調(diào)節(jié)血管舒縮、排尿、排便和性功能活動(dòng)的低級(jí)反射中樞。一旦脊髓受損，必定會(huì)給受傷者帶來沉痛的打擊?？梢姡钊肓私饧顾钃p傷后發(fā)生的變化具有重要的意義。

注：a為正常組，b為術(shù)后1 d組，c為術(shù)后7 d組，d為術(shù)后14 d組，e為術(shù)后21 d組，f為術(shù)后28 d組;箭頭所指為線粒體

1965年Moore等[7]首先在牛腦組織中發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)源性蛋白(S-100)，因其能溶解在100%的硫酸銨飽和溶液中而得名。S-100蛋白家族大約有16個(gè)成員，其中S-100A和S-100B是其主要成員。S-100B具有高度腦特異和神經(jīng)保護(hù)作用，可以提高神經(jīng)元的存活率、促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)突起、促進(jìn)軸突的延伸,它在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最多[8-9]。S-100B有多種生理功能：(1)調(diào)節(jié)多種蛋白激酶的底物磷酸化，調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性；(2)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度，保護(hù)神經(jīng)元免受氧化損傷；(3)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化，參與微管、微絲的解聚；(4)被分泌到細(xì)胞外，低濃度具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，但高濃度可引起神經(jīng)元變性和誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[10-11]。另外它還可以作為白細(xì)胞的化學(xué)趨化因子，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。因此S-100B對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響，并在CNS受損時(shí)，通過急性膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)增加S-100B合成和分泌參與神經(jīng)損傷修復(fù)機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，SCI后，傷側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)、感覺功能逐漸恢復(fù)，14 d時(shí)恢復(fù)最明顯；S-100B也在SCI后開始增加，14 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。脊髓損傷機(jī)制包括即刻機(jī)械損傷和隨之發(fā)生的血管、生化反應(yīng)所致的繼發(fā)性損害。有研究將脊髓損傷分為3期，(1)急性期：即傷后至最初幾天內(nèi)，為脊髓及周圍組織包括血管內(nèi)皮受到初始機(jī)械損傷，壞死及細(xì)胞死亡瞬間發(fā)生；受傷幾分鐘后，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)發(fā)生電解質(zhì)紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)功能衰竭和脊髓休克，并持續(xù)約24 h。SCI早期，大量損傷及壞死的細(xì)胞被動(dòng)釋放S-100B，在一定范圍內(nèi)， 表達(dá)上調(diào)的S-100B可以刺激神經(jīng)元生長(zhǎng)、增強(qiáng)神經(jīng)元在損傷后的存活；(2)繼發(fā)反應(yīng)期：傷后數(shù)周內(nèi)，機(jī)械損傷致細(xì)胞溶解，突觸或非突觸間的運(yùn)輸，使得細(xì)胞外谷氨酸鹽及其他刺激性氨基酸濃度急劇升高，脂質(zhì)過氧化和氧自由基產(chǎn)生，多種原因?qū)е路磻?yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞過多以及星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖；星形膠質(zhì)細(xì)胞增生、活化大量分泌S-100B，高濃度的S-100B對(duì)鄰近的易感神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，從而影響神經(jīng)損傷的修復(fù)[12-13]；(3)慢性期：發(fā)生在受傷后數(shù)天至數(shù)年，主要機(jī)制有細(xì)胞程序性死亡范圍擴(kuò)大，一些受體及離子通道濃度和活性改變，瘢痕出現(xiàn)，脫髓鞘導(dǎo)致傳導(dǎo)功能受損，囊性變，脊髓空洞區(qū)域擴(kuò)大。Carlson等[14]總結(jié)了繼發(fā)性脊髓損傷不同機(jī)制，包括缺血、生化改變、程序性細(xì)胞死亡、毒性刺激物、神經(jīng)遞質(zhì)的積聚、脂質(zhì)過氧化和自由基的產(chǎn)生及炎癥反應(yīng)等，認(rèn)為神經(jīng)功能最終缺陷是由于繼發(fā)性損傷復(fù)合機(jī)制所致。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠SCI模型，初步探討了早期及繼發(fā)反應(yīng)期S-100B的表達(dá)與損傷恢復(fù)時(shí)間變化規(guī)律。隨著實(shí)驗(yàn)研究不斷進(jìn)展，對(duì)脊髓損傷病理生理全面認(rèn)識(shí)及早期治療將會(huì)大大減少了脊髓損傷致死率、住院率及并發(fā)癥幾率，提高患者早期康復(fù)及重返社會(huì)工作的機(jī)會(huì)。

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(2015-06-07收稿，2015-07-04修回)

中文編輯： 周 凌； 英文編輯： 劉 華

Changes in S-100B Expression of Astrocytes after Experimental Hemi-sectioned Spinal Cord Injury of Rats

ZOU Yun, YU Zijiang, LIN Jintang

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Objective: To investigate the expression of S-100B protein of astrocytes after spinal cord injury (SCI)．Methods: Seventy healthy adult male SD rats were selected and randomly divided into 3 groups: normal control group, sham group and model of SCI group (1 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d after SCI). After the establishment of animal model of SCI, the functional recovery of the hind limb was evaluated by using BBB(Basso, Beattie and Bresnahan locomotor rating scale)and Reuter score at 1 d, 7 d, 14 d, 21 d and 28 d. After hind limb function was scored, the rats were sacrificed to undergo S-100B immunohistochemistry staining. Western blot was adopted to detect the expression of S-100B protein in damaged area and transmission electron microscope to observe the morphological change of spinal cord after SCI in rats Results: (1)In BBB and Reuter score evaluation, the rats of SCI model groups paralyzed and showed sensory disturbance after anesthetic awareness. The neurologic function of the SCI rats' hind limb began to recover gradually, with the recovery being most obvious at 14thd. (2)HE staining showed that S-100B protein expression in each experimental groups were higher than that of normal control and sham group, with S-100B protein expression reaching the highest level at 14thd. The astrocyte in the SCI area proliferated and hypertrophied. At 28thd S-100B protein expression tended to be stable. (3)The detection of S-100B protein expression by Western blot was consistent with result of immunohistochemistry staining. (4)Under transmission electron microscope, in injured area after SCI, the neurons swelling and degeneration, the decreased number of cell organelle, mitochondrial edema and vacuolar degeneration could be observed. Conclusion: After SCI, the increased S-100B protein expression and astrocyte proliferation may be related to self-repair and regeneration of injured nerve.

spinal cord injury; restoration; nerve regeneration; astrocyte derived protein; rats, Sprague-Dawley

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81060108)

時(shí)間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2246.020.html

R322.81

A

1000-2707(2015)09-0900-05

**通信作者 E-mail:893767473@qq.com