李蘭崇 尹志芳 楊宇強 湯梓雄 王玲

幾種銀杏類制劑中銀杏酸的高效液相色譜法測定

李蘭崇 尹志芳 楊宇強 湯梓雄 王玲

采用正己烷提取, 薄層色譜純化, 高效液相色譜法(HPLC)檢測并考察幾種銀杏類制劑總銀杏酸的含量。色譜條件為Hypersil ODS C-18(150 mm×4.6 mm.5 μm)；流動相組成為甲醇-3% HAc溶液(92:8, V/V), 紫外檢測波長306 nm, 流速1.0 ml/ min, 柱溫40℃, 進樣量：20 μl, 外標法計算含量。結(jié)果表明：總銀杏酸線性回歸方程為：Y=4998X-100492, r2=0.9986, 線性關(guān)系良好。標準品和樣品的相對標準偏差RSD均為0.38%, 表明儀器精密度良好。7種銀杏產(chǎn)品中, 采摘的新鮮銀杏葉中總銀杏酸的含量接近于1%, 其余6種市場上的銀杏制劑總銀杏酸含量均較大程度超過10 ppm。其中, 這一研究結(jié)果為正確使用銀杏葉產(chǎn)品提供了參考。

銀杏類制劑；銀杏酸；高效液相色譜法

近年來, 各種銀杏類制劑如銀杏茶、銀杏片、銀杏膠囊、銀杏注射液因含有較高的總黃酮醇苷、萜類內(nèi)酯等, 具有降血糖, 軟化血管等功效, 逐漸廣泛使用于治療心腦血管類疾病。但同時還含有一類有毒成分銀杏酸, 具有致敏性［1,2］、細胞毒性［3,4］和免疫毒性［5］等作用, 其食用安全性已引起人們的高度重視。按照《中國藥典2010版》對銀杏葉藥材的質(zhì)量標準規(guī)定, 有效成分總黃酮不得少于0.4%、銀杏總內(nèi)酯不得少于0.25%。對其毒性成分總銀杏酸的含量不得超過百萬分之十。從藥品安全性角度考慮, 德國Schwabe公司1991年專利中提出銀杏酸類化合物含量要求低于10 mg/kg, 德國衛(wèi)生部1997年提出銀杏酸含量應(yīng)低于5 mg/kg［6］?；诖? 本實驗從市面上購買了幾種不同的銀杏產(chǎn)品, 采用正己烷提取,薄層色譜純化, HPLC法檢測考察其中銀杏酸的含量。

1 材料與方法

1.1 材料 銀杏葉片a(樣品1)、銀杏葉片b(樣品2)、銀杏膠囊a(樣品3)、銀杏膠囊b(樣品4)、銀杏茶a(樣品5)、銀杏茶b(樣品6)：市售。銀杏葉(樣品7)采集于湖南城市學(xué)院校園, 樹齡4～5年, 于太陽下暴曬至干, 存于密封容器中備用(經(jīng)測定含水率為11.75%), 銀杏酸標準品：上海江萊生物科技有限公司, 并提供了銀杏酸的組成和含量(C13：0, 6.2%；C15：1.32.22%；C17：2.1.54%；C15：0.1.14%；C17：1.12.474%), 純度＞99%。甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、石油醚：色譜純；超純水。

1.2 實驗儀器 FC-104型電子天平(萬分之一)：上海精密儀器有限公司；索氏提取儀：上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；LC-10AT 型高效液相色譜儀：日本島津有限公司；U-3010型紫外可見分光光度計：日本島津有限公司；RE-2000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏酸標準品溶液的制備 準確稱取5 mg銀杏酸A與10 mg銀杏酸B用色譜純甲醇溶解定容至100 ml, 得濃度為150 μg/ml的銀杏酸對照品溶液。分別準確移取6.00、7.00、8.00、9.00、10.00 ml銀杏酸對照品溶液用甲醇稀釋定容至10 ml得濃度為90、105、120、135、150 μg/ml銀杏酸標準溶液。分別吸取20 μL系列濃度的銀杏酸標準溶液進樣, 測定C13：0、C15：1、C17：2、C15：0、C17：1的峰面積并加和, 以濃度X為橫坐標、總峰面積值Y為縱坐標繪制標準曲線, 并進行線性回歸, 得回歸方程。

1.2.2 樣品溶液的制備 由于5種樣品中的銀杏酸含量差異較大, 故采用了不同的處理方式制備樣品溶液。

樣品1～6的制備方法［7］：將樣品干燥后粉碎, 分別稱取20 g粉末(銀杏膠囊則取膠囊內(nèi)粉末), 加入3000 ml經(jīng)正己烷于85℃下索氏提取10 h, 收集正己烷提取溶液在40℃減壓濃縮至干, 用正己烷定容至1 ml。

樣品7的制備方法［7］：將銀杏葉干燥后粉碎, 稱取2 g粉末, 加入300 ml經(jīng)正己烷于85℃下索氏提取10 h, 收集正己烷提取溶液在40 ℃減壓濃縮至干, 用正己烷定容至10 ml。

其余步驟相同［8］：采用微量注射器吸取0.5 ml樣品溶液在薄層板上進行條狀點樣, 展開劑(石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸=18：1：1)展開后, 置于三用紫外儀254 nm下, 選取藍色熒光部分物質(zhì)進行甲醇洗脫, 定容至5 ml, 微孔濾膜過濾后上機進樣分析。再根據(jù)樣品溶液中銀杏酸的濃度確定溶液適度的稀釋倍數(shù)。

1.2.3 色譜分析條件 根據(jù)文獻［7］報道, 銀杏酸分析的流動相組成為甲醇-3% HAc溶液(92:8, V/V)；色譜柱：Hypersil ODS C-18(150 mm×4.6 mm.5 μm)；紫外檢測波長306 nm, 流速1.0 ml/min, 柱溫40℃, 進樣量：20 μl。色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為N2000型色譜工作站, 浙江大學(xué)智能信息研究所研制。

1.2.4 精密度實驗 在上述色譜條件下, 分別取150 μg/ml的銀杏酸標準品及樣品1提取液注入液相色譜儀, 每次進樣20 μl, 連續(xù)進樣5次, 獲得峰面積, 計算相對標準偏差RSD。

1.2.5 加標回收率的測定 加標回收率的測定：采用加標回收法, 準確吸取4 m.150 μg/ml的銀杏酸標準品溶液及5 ml濃度為100 μg/ml銀杏樣品提取液至容量瓶中搖勻, 定容至10 ml, 進樣20 μl, 平行實驗5次, 測平均回收率。

2 結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇 準確移取150 μg/ml的銀杏酸對照溶液2 ml于10 ml容量瓶中, 用甲醇稀釋至刻度線, 以甲醇溶液作為參比溶液, 用紫外-可見光分光光度計在200～600 nm掃描, 得到其吸收光譜曲線如圖1(實踐)所示, 吸收波長為306 nm。準確移取樣品7提取液1 ml置于10 ml容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度線, 準確移取1 ml置于10 ml容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度線, 以甲醇溶液作為參比溶液, 得到其吸收光譜曲線如圖1(虛線)所示, 與銀杏酸對照品的光譜圖基本一致, 因此選擇306 nm作為測定波長。

2.2 色譜條件對銀杏酸分析效果的影響 按照1.2.2檢測條件測得的銀杏酸標準品的出峰如圖2所示, 說明該條件下5種銀杏酸所有的峰都完全分離, 分離度較好。其出峰順序分別為C13：0、C15：1、C17：2、C15：0、C17：1, 出峰時間分別為10.948、11.882、13.765、17.365、18.665 min, 由于C17：1存在同分異構(gòu)體, 在圖中有小的肩峰。

2.3 銀杏酸外標曲線的確定 按照“2.2.3”的方法得到的總銀杏酸線性回歸方程為：Y=4998X-100492, r2=0.9986。線性關(guān)系良好。見圖3。

圖1 銀杏酸對照品及銀杏葉(樣品7)提取物的吸收光譜圖

圖2 銀杏酸標準品的HPLC圖譜

圖3 銀杏酸標準品的線性擬合曲線

2.4 精密度測定

標準品和樣品的相對標準偏差RSD均為0.38%, 表明儀器精密度良好。見表1。

2.5 樣品中銀杏酸含量及加標回收率的測定, 見表2。

表1 精密度試驗

表2 銀杏茶樣品分析及加標回收試驗(n=5)

3 討論

目前, 國際公認標準為人用治療劑量中, 總銀杏酸的允許最大攝入量為600～1200 μg/d［9］。銀杏葉片及銀杏膠囊的產(chǎn)品規(guī)格一般為0.2～0.5 g/片, 每日用量一般為3～6片/粒,根據(jù)表2中的銀杏酸含量計算, 因此銀杏酸的日攝入量為均＜600 μg, 攝入總量沒有超過國家標準, 但產(chǎn)品中銀杏酸的含量遠遠高于國家標準10 ppm。同種類型, 不同廠家的銀杏產(chǎn)品銀杏酸含量也有較大差異。因此這些市售的銀杏葉保健食品, 雖然具有調(diào)節(jié)人體某些機能的作用, 但適合于某些特定人群食用, 且不適宜于長期食用。而未經(jīng)加工的銀杏葉中銀杏酸含量接近1%, 只能作為生產(chǎn)藥品的原材料。

［1］ 楊小明, 陳鈞.烷基酚酸的生物活性研究進展.中草藥.2003.34(5):5-6.

［2］ Westendorf J, Regan J. Induction of DNA strand-breaks in primary rat hepatocytes by ginkgolic acids. Pharmazie.2000.55(11):864-865.

［3］ Baron-Ruppert G, Luepke NP. Evidence for toxic effects of alkyphenols from Ginkgo bilobain the hen’s egg test. Phy-tomedicine.2001, 8(2):133-138.

［4］ Gutendorg B, Regan J, Westendorf J. Induction of DNA strand breaks and tumor promotion in primary rat hepatocytes by ginkgolic acids. Toxicologist.2001(60):288.

［5］ Koch E , Jaggy H, Chatterjee SS, et al. Evidence for immunotoxic effects of crude Ginkgo biloba L. leaf extracts using popliteal lymph node assay in the mouse. International Journal of Immunopharmacology.2000.22(3):229-236.

［6］ Liu XP, Goldring CE.Wang HY, et al. Extract of Ginkgo biloba induces glutathione-S-transferase subunit-P1 in vitro. Phytomedicine.2009.16(5):451-455.

［7］ 仰榴青, 吳向陽, 陳鈞.高效液相色譜法測定銀杏外種皮銀杏酸的含量.分析化學(xué).2002.30(8):901-905.

［8］ 秦俊哲, 郭云霞.薄層層析-紫外分光光度法測定銀杏茶中銀杏酸含量.陜西科技大學(xué)學(xué)報.2012.30(1):4-6.

［9］ 吳向陽, 仰榴青, 陳鈞. 高效液相色譜法測定銀杏葉提取物及其制劑中銀杏酸份量. 藥學(xué)學(xué)報.2003.38(11):365-366.

High performance liquid chromatography detection of ginkgolic acids in several kinds of ginkgo preparations

LI Lan-chong, YIN Zhi-fang, YANG Yu-qiang,
et al. School of Chemical and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyan.413000, China

A detection method of ginkgolic acids in ginkgo preparations by high performanceliquid chromatography (HPLC) was established with extraction of n-hexane and purification of thin-layer chromatography. The chromatographic condition was Hypersil ODS C-18 (150 mm×4.6 mm.5 μm). The composition of mobile phase was methanol-3% HAc solution (92:8, V/V). Ultraviolet detection wavelength wa.306 nm, flow velocity wa.1.0 ml/ min, column temperature wa.40℃, and sample amount wa.20 μl. The content was calculated by external standard method. The results showed that the linear regression equation of ginkgolic acids was Y=4998X-100492, r2=0.9986, and the linear relation was good. The relative standard deviations RSD of standard and extraction samples were all 0.38%, which showed the instrument had good precision. In 7 ginkgo samples, the content of ginkgolic acids in fresh ginkgo leaf wa.1%, and that of the other 6 ginkgo drugs were all abov.10 ppm. This study provided references for correct use of ginkgo preparations.

Ginkgo preparations; Ginkgolic acids; High performance liquid chromatography

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.01.175

2014-09-05］

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(項目編號：201211527007)

413000 湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院