蒲艷

AnnexinⅡ在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)

蒲艷

目的 研究鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ(AnnexinⅡ)在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)意義。方法 以肝細(xì)胞癌組織和非腫瘤肝組織進(jìn)行抑制差減雜交技術(shù)(SSH), 構(gòu)建正、反向差減雜交文庫(kù), 差減片斷的PCR產(chǎn)物制備cDNA芯片, 篩選出肝細(xì)胞癌組織中差異表達(dá)基因。使用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)驗(yàn)證芯片結(jié)果, 免疫組化方法分析AnnexinⅡ在肝細(xì)胞癌和正常肝組織中的表達(dá)。結(jié)果 AnnexinⅡ在肝細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá),在肝細(xì)胞癌和癌旁肝硬化組織中也呈現(xiàn)高表達(dá), 正常肝臟組織沒有表達(dá), 低分化肝細(xì)胞癌中具有增高的趨勢(shì)。結(jié)論 在肝細(xì)胞癌的檢查和診斷期間, AnnexinⅡ可以作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)之一, 觀察患者肝細(xì)胞惡化或轉(zhuǎn)移、侵襲的情況。

肝細(xì)胞癌；鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ；免疫組化

本次研究主要針對(duì)肝細(xì)胞癌中的AnnexinⅡ表達(dá)情況,觀察不同患者之間的表達(dá)差異性, 分析AnnexinⅡ在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本次研究選取本院病理診斷為肝細(xì)胞癌患者, 并進(jìn)行肝移植手術(shù)1例, 同時(shí)選取肝癌組織和非腫瘤肝組織數(shù)塊, 將其放入液氮中在-70℃下進(jìn)行保存, 選擇本院肝癌石蠟組織標(biāo)本79例, 其中男56例, 女23例, 年齡43～74歲, 平均年齡54歲?；颊叩母伟┌Y狀按照WHO劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分, 其中Ⅰ級(jí)21例,Ⅱ級(jí)37例,Ⅲ級(jí)21例。選取(本院鑒定中心提供)正常肝石蠟組織8例, 其中男5例,女3例, 年齡43～77歲, 平均年齡54歲。

1.2 材料 研究使用的材料主要包括：美國(guó)Clontech公司提供的PCR-SelectTMcDNA Substraction Kit；美國(guó)Qiagene公司提供的mRNA磁珠法純化試劑盒、Sigma公司出產(chǎn)的Trizol；Promega公司生產(chǎn)的Rnaseinhibitor和M-MLV RT；A&B公司出產(chǎn)的SYBR Green PCR Master Mixture;武漢博士的公司出產(chǎn)的AnnexinⅡ多克隆抗體；福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司出產(chǎn)的Elicision Plus, 分析純?cè)噭┻x用進(jìn)口分裝。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建抑制差減雜交文庫(kù) 將100 mg的肝癌組織和非腫瘤肝組織分別放入1 ml Trizol當(dāng)中勻漿, 氯仿和異丙醇抽提, 之后對(duì)所抽提RNA的A260及A280進(jìn)行測(cè)定, 計(jì)算A260除A280確定RNA的純度及質(zhì)量, 使用磁珠法純化試劑盒純化分離mRNA, 操作按照說明書的使用標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行, 構(gòu)建差減雜交文庫(kù), 將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆進(jìn)入pMD-18T載體, 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌, 并使用藍(lán)白斑法篩選陽性克?。?］。

1.3.2 進(jìn)行cDNA芯片的制作 擴(kuò)增陽性克隆中的插入片段, 純化PCR產(chǎn)物后進(jìn)行cDNA芯片制備, 為cDNA測(cè)序及同源性的分析, 將cDNA芯片結(jié)果顯示在肝癌組織中的差異表達(dá)克隆進(jìn)行測(cè)序, 并使用Blast進(jìn)行比對(duì), 進(jìn)一步分析在發(fā)生或肝癌發(fā)展當(dāng)中具有影響較大的基因。

1.3.3 分別提取、逆轉(zhuǎn)錄肝癌組織和肺腫瘤肝組織RNA 選取cDN.40 ng, 上下游引物各20 mol/L及2×SYBR Green PCR Master Mixtur.10 μl, 在蒸餾水不足反應(yīng)體系20 μl, 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI Prism 7000上進(jìn)行。計(jì)算樣本中AnnexinⅡ的mRNA拷貝數(shù)相對(duì)量。免疫組化按照Elivision plus試劑盒的操作要求進(jìn)行, PBS代替一抗體作為陰性對(duì)照參考, 使用Leica RX型圖像分析系統(tǒng)采集圖像分析免疫組化的結(jié)果, Qwin軟件識(shí)別陽性表達(dá)面積和積分灰度值, 每一張切片采集5個(gè)視野, 視野為×200, 其中陽性的表達(dá)面積比在5%以上,反之為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次研究使用SPSS18.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用單因素分析, 兩兩比較采用SNK法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA的完整性 本次檢驗(yàn)的RNA和mRNA的A260/A280＞1.8,研究成功構(gòu)建差減文庫(kù), 插入的片段通過PCR的鑒定, 結(jié)果在96%以上的克隆都具有擴(kuò)增產(chǎn)物, 產(chǎn)物在200～700 bp之間, 通過對(duì)肝細(xì)胞癌中的高表達(dá)克隆測(cè)序, 并對(duì)其進(jìn)行Blastn比對(duì), 發(fā)現(xiàn)一個(gè)與AnnexinⅡ同源性為100%的基因, 檢驗(yàn)分析認(rèn)定為AnnexinⅡ基因。通過熒光定量檢測(cè), 肝癌組織中的AnnexinⅡ的mRNA拷貝數(shù)是非腫瘤肝組織的4.05倍。

2.2 免疫組織化學(xué) 通過肝細(xì)胞癌組織和癌旁肝硬化組織與正常肝組織進(jìn)行比較, 結(jié)果AnnexinⅡ的陽性表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 其中肝細(xì)胞癌、癌旁肝硬化與正常肝組織比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 而癌旁肝硬化組織與正常肝組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 見表1。

2.3 在肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織當(dāng)中的AnnexinⅡ表達(dá)陽性率比較當(dāng)中, 肝細(xì)胞癌與正常組織差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而高中分化、中低分化、高低分化比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 見表2。

表1 肝細(xì)胞癌組織、癌旁肝硬化組織與正常肝組織當(dāng)中的AnnexinⅡ表達(dá)陽性面積百分比及積分灰度值比較(s)

表1 肝細(xì)胞癌組織、癌旁肝硬化組織與正常肝組織當(dāng)中的AnnexinⅡ表達(dá)陽性面積百分比及積分灰度值比較(s)

注：在組別比較之間, 肝細(xì)胞癌與正常肝組織相比,aP＜0.05；癌旁肝硬化與正常肝組織相比,bP＜0.05；癌旁肝硬化組織與正常肝組織相比,cP＞0.05

組別陽性面積百分比(%)積分灰度值(×106)肝細(xì)胞癌組織高分.10.589±14.108a.10.892±14.002a中分化 6.671±8.939a7.512±9.512a低分化 7.881±8.091a8.398±8.201a癌旁肝硬化組織.23.033±11.087bc.23.579±10.498bc正常肝組織0.054±0.0850.048±0.072

表2 肝細(xì)胞癌組織和正常肝組織中的AnnexinⅡ表達(dá)陽性率(n, %)

3 討論

本次研究通過實(shí)驗(yàn)室研究分析, 采用芯片篩選的方法,觀察肝細(xì)胞癌的差異表達(dá)基因, 研究的可信度較高, 研究中的AnnexinⅡ已經(jīng)不僅僅只是參與炎癥反應(yīng)機(jī)制方面的內(nèi)容,同時(shí)AnnexinⅡ還是核心區(qū)保守, N端存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 可以通過癌基因pp60v-src、血小板源性生長(zhǎng)因子受體和胰島素受體在酪氨酸23進(jìn)行磷酸化修飾, 蛋白激酶C在絲氨酸25進(jìn)行磷酸化修飾, 進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化等均發(fā)揮著重要的功能。通過研究發(fā)現(xiàn), AnnexinⅡ和細(xì)胞分類調(diào)控及腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)系非常緊密, 如果AnnexinⅡ的表達(dá)失調(diào), 那么癌細(xì)胞的表達(dá)也往往上調(diào)［2］。本次同源性研究中發(fā)現(xiàn)AnnexinⅡ的mRNA拷貝數(shù)是正常肝組織的4.05倍, 而其他也均表現(xiàn)為高表達(dá)的結(jié)果, 免疫組化分析當(dāng)中, 所有高中低分化肝細(xì)胞癌組織的陽性表達(dá)率均較高, 與正常肝組織的差異性較大,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 證實(shí)AnnexinⅡ在肝細(xì)胞癌當(dāng)中具有較強(qiáng)的差異表達(dá)性, 也已在一定程度判定肝細(xì)胞癌患者的發(fā)生及發(fā)展。

［1］ Stewart BW, Kleihues P. World Cancer Report. Ly-on: IARC.2003:1-351.

［2］ 陳建國(guó), 宋新明.中國(guó)肝癌發(fā)病水平的估算與分析.中國(guó)腫瘤.2005.14(1):28-31.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.01.023

2014-08-05］

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