高 永,楊支力,李東海,徐 濤

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018)

半夏凝集素結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

高 永,楊支力,李東海,徐 濤

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,杭州 310018)

為進(jìn)一步深入了解半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin)已知蛋白序列的性質(zhì),采用生物信息學(xué)預(yù)測方法,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)性分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取半夏凝集素蛋白序列信息,利用 Expasy、SMART、CBS、SWISS-MODEL、 DNAman6.0等生物軟件對凝集素蛋白的一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行全面分析。半夏凝集素的基本結(jié)構(gòu)信息表明其屬于穩(wěn)定的親水性蛋白,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)含有16個(gè)α螺旋,91個(gè)β折疊和150個(gè)隨機(jī)卷曲,同源建模分析顯示半夏凝集素蛋白序列與模板巖芋凝集素蛋白A鏈和B鏈的同源相似度分別達(dá)76.15%和84.55%。高級結(jié)構(gòu)信息顯示半夏凝集素N端存在跨膜區(qū)域和信號肽區(qū)域,并且整個(gè)蛋白序列中存在多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和蛋白激酶磷酸化位點(diǎn),功能域預(yù)測表明半夏凝集素含有兩個(gè)B型凝集素功能域,每個(gè)功能域均含有保守的甘露糖結(jié)合位點(diǎn),并且這些結(jié)合位點(diǎn)多位于半夏凝集素蛋白空間構(gòu)象的外部。通過對半夏凝集素結(jié)構(gòu)性質(zhì)的預(yù)測為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物功能和藥用機(jī)理提供了有益參考。

半夏凝集素; 結(jié)構(gòu); 同源建模; 甘露糖特異性結(jié)合

0 引 言

半夏為天南星科半夏屬植物,其塊莖作為中藥材已在我國長期使用[1]。半夏在我國分布廣泛,四川、湖北、江西等地為道地產(chǎn)區(qū),其除了顯著的藥用效果以外,還具有抗蟲抑菌作用[2-3]。

半夏凝集素作為從半夏塊莖中提取的蛋白組分之一,具有顯著生物學(xué)功能。半夏凝集素基因已被廣泛用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)[4-5],不管是植物轉(zhuǎn)基因還是微生物反應(yīng)器[6],表達(dá)出來的半夏凝集素產(chǎn)物都表現(xiàn)出顯著的抗蟲、抑菌[7]、專一性結(jié)合甘露糖和促進(jìn)凝血[8]的特性。隨著半夏凝集素抑癌作用的發(fā)現(xiàn),當(dāng)前的重點(diǎn)主要集中在半夏凝集素抗腫瘤的研究上[9-10]。半夏凝集素能體外凝集惡性腫瘤細(xì)胞,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象顯示出其在腫瘤治療上的應(yīng)用前景,但其更為詳盡的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)從研究半夏凝集素基本序列信息入手,對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)全面的預(yù)測分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取本課題組提交的半夏凝集素蛋白序列信息,用Expasy、SMART、CBS、SWISS-MODEL、DNAman6.0等系列生物信息預(yù)測軟件分析半夏凝集素一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、功能性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)和功能域信息,為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和進(jìn)一步研究其蛋白性質(zhì)提供有益參考。

1 試 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

蛋白分析網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫:

NCBI(National Center for Biotechnology Information)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

PDB(Protein Data Bank)

http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

EMBL(European Molecular,Biology Laboratory)

http://www.ebi.ac.uk/

PIR(Protein Information Resource)

http://pir.georgetown.edu

UniProt

http://www.uniprot.org/

蛋白分析軟件:

Expasy系列

http://www.expasy.org/

SMART系列

http://smart.embl-heidelberg.de/

CBS系列

http://genome.cbs.dtu.dk/

SWISS-MODEL

http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 半夏凝集素蛋白一級結(jié)構(gòu)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取半夏凝集素蛋白序列(序列號AEZ35184.1)信息,用Expasy Compute pI/Mw tool、Expasy ProtScale、NCBI BlastP、DNAman6.0等工具分別對氨基酸殘基的理化性質(zhì),蛋白質(zhì)疏水性和多種凝集素蛋白間的同源關(guān)系進(jìn)行分析。

1.2.2 半夏凝集素蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用GRO3、GRO4、PHD、DSC、MLRC方法分別對半夏凝集素蛋白序列進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,比較這些預(yù)測方法之間的差異性,從中選擇接近真實(shí)結(jié)果的預(yù)測方法。

1.2.3 半夏凝集素蛋白的三級結(jié)構(gòu)同源建模

在Swiss-Model網(wǎng)站上采用自動(dòng)模式對半夏凝集素的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建。

1.2.4 半夏凝集素蛋白的其他功能性結(jié)構(gòu)的預(yù)測

用CBS TMHMM2.0軟件分析蛋白跨膜域,用CBS SignalP 4.1 Server分析蛋白信號肽位點(diǎn),用CBS TargetP 1.1 Server對蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析,用Expasy ScanProsite 、CBS DictyOGlyc、CBS NetPhosK 等工具對蛋白的豆蔻酰化、磷酸化、糖基化、甘露糖結(jié)合位點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測分析,用SMART軟件分析了凝集素蛋白的功能域結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 半夏凝集素蛋白一級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定了其高級結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在借助Expasy Compute pI/Mw tool 和Expasy ProtScale、NCBI BlastP及DNAman6.0對半夏凝集素的氨基酸殘基組成和蛋白序列信息進(jìn)行系統(tǒng)分析。

2.1.1 半夏凝集素蛋白基本理化性質(zhì)分析

半夏凝集素蛋白檢索號為AEZ35184.1(NCBI)或H8Y197(UniProtKB/TrEMBL),應(yīng)用Expasy Compute pI/Mw tool工具得到以下基本信息。半夏凝集素蛋白序列由257個(gè)氨基酸殘基組成,分子式為C1252H1968N354O370S8,相對分子質(zhì)量28 156.0,理論等電點(diǎn)pI為7.73,負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)23個(gè),正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)24個(gè),不穩(wěn)定系數(shù)較低,只有30.13,據(jù)此將其歸類為穩(wěn)定性蛋白。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分別見圖1和表1。

圖1 氨基酸殘基組分

表1 氨基酸殘基特性

2.1.2 半夏凝集素的疏水性分析

用Expasy ProtScale中 Hphob./Kyte & Doolittle算法工具分析半夏凝集素疏水性和親水性,結(jié)果如圖2所示。橫坐標(biāo)表示氨基酸殘基位點(diǎn),縱坐標(biāo)中正值代表疏水性,負(fù)值代表親水性。圖中第5～22位氨基酸殘基存在明顯疏水性,其中第9和10位氨基酸殘基的疏水性均達(dá)到最大,分值為2.944。而第191位的氨基酸殘基的疏水性達(dá)到最小的-2.167。根據(jù)圖中蛋白氨基酸殘基的相對疏水性趨勢,加上空間立體條件和其他因素影響,推斷這些疏水性氨基酸殘基位于蛋白構(gòu)象的疏水內(nèi)核,而一些親水性氨基酸殘基則位于蛋白構(gòu)象的親水表面,這將從一定程度上影響半夏凝集素蛋白質(zhì)在三維空間的折疊。

圖2 蛋白序列疏水性預(yù)測注:正值代表疏水性,負(fù)值代表親水性。

2.1.3 半夏凝集素序列比對與同源樹分析

通過蛋白序列的比對可視化地呈現(xiàn)了相關(guān)比對蛋白序列間的差異,在比對結(jié)果圖中可以清楚看到特定位點(diǎn)上氨基酸殘基的變化,這為研究蛋白的同源進(jìn)化和特殊位點(diǎn)氨基酸殘基的突變提供了有益參考。

首先在NCBI中對半夏凝集素蛋白序列(AEZ35184.1)進(jìn)行了BlastP分析,找到同源性匹配分值較高的凝集素蛋白序列。這里選取滴水珠凝集素(AGV40778.1)、掌葉半夏凝集素(AGV40779.1)、天南星凝集素(AAP50524.1)、東北天南星凝集素(ABY91323.1)、海芋凝集素(ABC69036.1)、巖芋凝集素(ACH41914.1)作為研究對象,將它們與半夏凝集素進(jìn)行分類學(xué)上的屬類同源比對。經(jīng)DNAman6.0軟件[11]分析,序列比對結(jié)果見圖3,從圖3可以看到,相同位點(diǎn)上氨基酸殘基在不同序列中有所差異。由圖4同源進(jìn)化關(guān)系可以看出,三葉半夏凝集素與同是半夏屬的掌葉半夏凝集素的同源性為88%,其次與同是天南星科的天南星凝集素、滴水珠凝集素、東北天南星凝集素的同源性依次為86%、84%、80%,而與不是同一植物科的海芋凝集素和巖芋凝集素的比對分值相對低一些,分別為80%和79%。從這個(gè)趨勢來看,同屬的蛋白序列相似度最高,同科的相似度次之,既不同屬也不同科的凝集素蛋白序列差異顯著。

圖3 凝集素蛋白序列比對注:顏色較深部分為序列完全相同部分,其他顏色較淺部分為序列不完全相同部分。

圖4 凝集素序列同源進(jìn)化樹

2.2 半夏凝集素蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是蛋白序列以氫鍵為主要作用力按照一定的方向經(jīng)盤繞、折疊而形成的空間構(gòu)象。這些結(jié)構(gòu)形式主要包括α螺旋,β折疊和不規(guī)則卷曲等,它們多參與蛋白質(zhì)功能域的構(gòu)建。

采用GRO3,GRO4,PHD,DSC,MLRC法分別對半夏凝集素蛋白序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測[12],預(yù)測結(jié)果見表2和圖5。綜合以上幾種不同方法得到的預(yù)測結(jié)果,半夏凝集素的二級結(jié)構(gòu)大致是,在其前端有一段α螺旋區(qū),接著β折疊和隨機(jī)卷曲依次出現(xiàn)在整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)中。

表2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測多重比較

圖5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測多重比較注:A為GRO3法預(yù)測結(jié)果,B為GRO4法預(yù)測結(jié)果,C為PHD法預(yù)測結(jié)果,D為PHD、DSC和MLRC的擬合結(jié)果;圖中最長豎線代表α螺旋,中長豎線代表β折疊,最短豎線代表隨機(jī)卷曲。

2.3 半夏凝集素蛋白的三維結(jié)構(gòu)同源建模

將半夏凝集素蛋白序列提交至Swiss Model,在First Approach Mode程序中搜索到具有晶體結(jié)構(gòu)的同源模板巖芋凝集素[13]A鏈3R0E.1.A(NCBI)和巖芋凝集素B鏈3R0E.1.B(NCBI),它們與半夏凝集素蛋白序列的同源比例分別為76.15%和84.55%,此得分遠(yuǎn)高于同源建模相似度應(yīng)在50%以上的要求。模建結(jié)果顯示3R0E.1.A的109個(gè)氨基酸殘基分別對應(yīng)半夏凝集素蛋白中的N端域V25～G133部分,3R0E.1.B的110個(gè)氨基酸殘基分別對應(yīng)半夏凝集素蛋白的C端域N142～S251部分。同源模型構(gòu)建及Ramachandran plot拉氏模型評價(jià)結(jié)果見圖6。

從預(yù)測結(jié)果來看,半夏凝集素蛋白N端域和C端域的三維結(jié)構(gòu)很相似,均成三棱柱型,每邊有3～4個(gè)不等的β折疊。而在N端域和C端域的二聚體擬合結(jié)構(gòu)中,它們成反向平行排列。拉氏模型評價(jià)半夏凝集素N端C端的擬合模型,得分為95.43%,即有95.43%的氨基酸殘基處在空間結(jié)構(gòu)的合理區(qū)域(圖中空心球代表處于合理位置的氨基酸殘基),只有G26,G33,G92,G105,G121,G153,G181,G185,G205,G237不在合理區(qū)域內(nèi)(圖中空心三角形代表處于不合理位置的氨基酸殘基),這表明同源模建的半夏凝集素蛋白三維結(jié)構(gòu)合理。

圖6 同源模型及模型評價(jià)注:(a)為半夏凝集素蛋白N端結(jié)構(gòu)域,模板為3R0E.1.A。(b)為半夏凝集素蛋白C端結(jié)構(gòu)域,模板為3R0E.1.A。(c)為半夏凝集素蛋白N端與C端結(jié)構(gòu)的二聚體擬合,為了區(qū)別,N端域用飄帶表示,C端域用管狀結(jié)構(gòu)表示。(d)為二聚體擬合模型的拉氏評價(jià)圖,橫坐標(biāo)表示Phi,縱坐標(biāo)表示Psi,空心球表示氨基酸殘基位于空間結(jié)構(gòu)的合理區(qū)域,空心三角形表示氨基酸殘基位于空間結(jié)構(gòu)的不合理區(qū)域。

2.4 半夏凝集素蛋白的功能預(yù)測

2.4.1 蛋白跨膜域分析

用CBS TMHMM2.0軟件對半夏凝集素蛋白序列進(jìn)行跨膜域預(yù)測分析，結(jié)果如圖7所示。膜內(nèi)區(qū)域?yàn)榈?～4位氨基酸殘基,跨膜區(qū)域?yàn)榈?～27位氨基酸殘基,相應(yīng)序列為LLLLFLPAILGLVIPRAAAAVGT,膜外區(qū)域?yàn)榈?8～257位氨基酸殘基。

圖7 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.4.2 蛋白信號肽分析

CBS SignalP 4.1 Server工具預(yù)測信號肽及其剪切位點(diǎn)。圖8中C值代表蛋白前體中信號肽得分,S值代表成熟蛋白中信號肽得分,Y值是C值和S值的擬合得分。C值最大得分位點(diǎn)為第24位氨基酸殘基,分值為0.635;Y值最大得分位點(diǎn)為第24位氨基酸殘基,分值為0.767;S值最大得分位點(diǎn)為第5位氨基酸殘基,得分0.979,一般認(rèn)為Y擬合值最高的氨基酸殘基之前的部分都屬于信號肽區(qū)域,因此確定第1～23位氨基酸殘基為信號肽殘基,剪切位點(diǎn)位于A23位和A24位之間的AA-AV連接處,得分值為0.854。

圖8 信號肽預(yù)測

2.4.3 蛋白的亞細(xì)胞定位

用CBS TargetP 1.1 Server分析半夏凝集素蛋白在亞細(xì)胞的定位。結(jié)果顯示,半夏凝集素蛋白的葉綠體定位得分為0.010,線粒體定位得分為0.076,而胞內(nèi)分泌途徑得分高達(dá)0.979,這說明半夏凝集素蛋白形成后多以分泌物形式存在細(xì)胞質(zhì)中,據(jù)此推斷半夏凝集素蛋白屬于分泌型蛋白。

2.4.4 蛋白中典型氨基酸殘基的磷酸化分析

蛋白磷酸化和去磷酸化過程參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號的傳導(dǎo)。用CBS NetPhos 2.0 Server分析了蛋白序列中容易發(fā)生磷酸化的絲氨酸S,蘇氨酸T,酪氨酸Y位點(diǎn)的磷酸化情況。圖9標(biāo)注了顯著的磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸S位點(diǎn)11個(gè),殘基位點(diǎn)分別為32,98,100,102,202,220,222,223,224,251,254;蘇氨酸T位點(diǎn)2個(gè),殘基位點(diǎn)為80,163;酪氨酸Y位點(diǎn)2個(gè),殘基位點(diǎn)為107,229。

圖9 典型磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

2.4.5 蛋白豆蔻?；?蛋白激酶磷酸化、糖基化及甘露糖特異性結(jié)合位點(diǎn)的分析

應(yīng)用多重預(yù)測工具對蛋白序列中的特異性位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測,信息總結(jié)于表3。從表3可以看出,半夏凝集素蛋白中發(fā)生豆蔻?；吞腔奈稽c(diǎn)較少,而發(fā)生蛋白激酶磷酸化[14]和特異性結(jié)合甘露糖的位點(diǎn)較多,這為半夏凝集素蛋白參與信號傳導(dǎo)和專一性結(jié)合甘露糖提供了有利條件。

2.4.6 蛋白功能域分析

用SMART工具預(yù)測半夏凝集素的功能域,發(fā)現(xiàn)半夏凝集素具有典型的B型凝集素結(jié)構(gòu)域特征,能專一地結(jié)合甘露糖,這一結(jié)果與凝集素蛋白同源序列比對和甘露糖結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測相一致。其他經(jīng)預(yù)測得到的功能域如FIST、IPT、Intergrin-B-tail、G8和DSL(結(jié)果見表4)有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證來確定這些功能域在半夏凝集素蛋白中是否真的存在。

表3 半夏凝集素特異性結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

表4 蛋白功能域預(yù)測

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取半夏凝集素蛋白序列信息,經(jīng)Expasy、SMART、CBS、SWISS-MODEL等生物信息預(yù)測軟件對凝集素蛋白的一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行全面分析。

基本結(jié)構(gòu)信息預(yù)測表明,半夏凝集素在理化性質(zhì)上屬于穩(wěn)定的親水性蛋白,DNAman6.0軟件對選取的半夏屬和巖芋屬蛋白進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)半夏凝集素與掌葉半夏凝集素和天南星凝集素有較高同源性,而與滴水珠凝集素、東北天南星凝集素以及海芋凝集素和巖芋凝集素的同源性依次降低。多種二級結(jié)構(gòu)預(yù)測方法顯示人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測法更接近半夏凝集素的真實(shí)折疊情況,該方法預(yù)測凝集素二級結(jié)構(gòu)含16個(gè)α螺旋,91個(gè)β折疊和150個(gè)隨機(jī)卷曲。

實(shí)驗(yàn)在對半夏凝集素高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析時(shí),采用Swiss Model同源建模法構(gòu)建出半夏凝集素的空間結(jié)構(gòu)模型。序列比對結(jié)果顯示,半夏凝集素蛋白與模板巖芋凝集素A鏈和B鏈的序列相似度分別為76.15%和84.55%,明顯高于同源建模的序列同源性應(yīng)大于50%的要求。用拉氏法評估構(gòu)建出的半夏凝集素空間模型,其與模板巖芋凝集素的A鏈和B鏈晶體結(jié)構(gòu)的正確匹配率分別為93.51%和93.57%,而半夏凝集素N端和C端的二聚體擬合結(jié)構(gòu)模型的正確匹配率高達(dá)95.43%,由此可知構(gòu)建出的半夏凝集素的模型具有很高的準(zhǔn)確性,可以用于后續(xù)模擬分子對接和藥物靶點(diǎn)虛擬篩選試驗(yàn)。

另外經(jīng)功能性結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件分析,半夏凝集素N端存在一個(gè)含有23個(gè)氨基酸殘基的跨膜區(qū)域,而該區(qū)域也是半夏凝集素蛋白的信號肽所在區(qū)域。整個(gè)蛋白序列中存在多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)和蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。功能域預(yù)測表明半夏凝集素含有兩個(gè)B型凝集素功能域,每個(gè)功能域中都含有甘露糖結(jié)合位點(diǎn),它們多裸露于蛋白空間構(gòu)象的外部,這為半夏凝集素蛋白與甘露糖或甘露糖復(fù)合物的結(jié)合提供了有利條件。

本文通過對半夏凝集素的結(jié)構(gòu)性質(zhì)的系統(tǒng)性預(yù)測分析,為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物功能和藥用機(jī)理提供有益參考。

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(責(zé)任編輯：許惠兒)

Prediction Analysis ofPinelliaTernataAgglutininStructure

GAOYong,YANGZhi-li,LIDong-hai,XUTao

(School of Life Science,Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China)

To further understand the properties of known protein sequence ofPinelliaternataagglutinin,bioinformatics prediction method was used to carry out a systematic analysis of its structure.Protein sequence information ofPinelliaternataagglutininwas retrieved from NCBI database.Expasy,SMART,CBS,SWISS-MODEL,DNAman6.0 and other bioinformatics prediction software were applied to overall analyze primary structure and senior structure of agglutinin protein.Basic structure information ofPinelliaternataagglutininindicates it belongs to stable hydrophilic protein.Artificial neural network method was used to predict its secondary structure contained 16 α-helices,91 β-strands and 150 random coils.Homologous modeling analysis indicates that homologous similarity between protein sequence ofPinelliaternataagglutininandRemusatiaViviparalectin’ Chain A & Chain B reaches 76.15% and 84.55% respectively.The advanced structure information reveals that transmembrane region and signal peptide region exist in N-terminal ofPinelliaternataagglutinin,and multiple N-glycosylation sites and protein kinase phosphorylation sites exist in the whole protein sequence.Functional domain prediction showsPinelliaternataagglutinincontains two B-type lectin domains,and each domain contains conserved mannose binding sites.Most of these protein binding sites are located outside of the space configuration ofPinelliaternataagglutinin.Prediction of structure nature ofPinelliaternataagglutininprovides useful reference for further experimental verification of its biological function and medicinal mechanism.

Pinelliatenataagglutinin; structure; homologous modeling; mannose-specific binding

1673-3851 (2015) 02-0269-07

2014-07-28

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30772712)

高 永(1986-),男,安徽阜陽人,碩士研究生,主要從事分子遺傳學(xué)與天然產(chǎn)物化學(xué)方面的研究。

徐 濤,E-mail:xutao1998cn@163.com

Q51

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