周馳凱,潘 強

(浙江理工大學生命科學學院新元醫(yī)學與生物技術研究所,杭州 310018)

6種化合物對肝癌細胞活性影響的比較

周馳凱,潘 強

(浙江理工大學生命科學學院新元醫(yī)學與生物技術研究所,杭州 310018)

肝癌在全球,特別是在中國,有著很高的發(fā)病率。在中國,每10萬人中約有將近40人罹患肝癌。在臨床治療肝癌等癌癥的方法上,最常用最普遍的手段是手術治療和化學治療等方法。不同的化合物對不同的癌癥細胞的細胞活力影響有很大的不同。為了比較不同的化合物對體外培養(yǎng)的肝癌細胞的細胞活力的影響,做了如下實驗。利用MTT檢測細胞活力的方法,分別檢測了不同濃度的阿霉素,順鉑,依托泊苷,5-FU,甲硫噠嗪和白藜蘆醇等6種常用化合物對肝癌細胞的細胞活力影響。實驗結果表明,阿霉素,依托泊苷,甲硫噠嗪和白藜蘆醇的IC50值分別為0.25 μg/mL,20 μg/mL,500 μM,20 μM。在一定的濃度范圍內(nèi),隨著阿霉素濃度的升高,肝癌細胞的細胞活力顯著下降,正常肝細胞的活力也有一定的下降;隨著依托泊苷的濃度的增加,肝癌細胞和正常肝細胞的細胞活力都顯著下降;隨著甲硫噠嗪的濃度的增加,肝癌細胞活力顯著下降,正常肝細胞的活力幾乎沒有影響。

肝癌; 細胞; 化學治療; 化合物; 細胞活性

0 引 言

肝癌,是一種常發(fā)疾病,在人類癌癥發(fā)病率中位列第三[1]。特別是在中國,有著很高的肝癌發(fā)病率,全世界大約有50%的肝癌患者在中國[2]。治療肝癌已經(jīng)到了刻不容緩的地步。肝癌可以通過手術和化學治療等手段進行有效的治療[2-3]?；瘜W治療,又稱化療,使用一種或者多種對腫瘤細胞具有細胞毒性的藥物進行治療的方法[4-5]?；煵粌H可以對原發(fā)腫瘤有效,對轉(zhuǎn)移性腫瘤同樣具有殺傷作用[6]。不同的化合物有著不同的作用機理。一些是抑制DNA合成或者造成DNA損傷的基因毒性化合物。例如阿霉素(Doxorubcin),5-FU,順鉑(Cisplatin)和依托泊苷(Etoposide)等。還有一些是特異性抑制激酶活性。例如白藜蘆醇(Resveratrol),甲硫噠嗪(Thioridazine)等。篩選出具有特異性的潛在的抗癌藥物,對癌癥的治療有重大的意義。藥物的研發(fā)到臨床的應用,要經(jīng)歷一個漫長的過程。通過在細胞水平上研究某一化合物對癌癥細胞活性的影響,可以初步建立一個候選化合物庫。

為了達到這一目的,篩選出具有高特異性的影響肝癌細胞的細胞活性的化合物,本研究利用這6種化合物在不同濃度的狀態(tài)下對肝癌細胞的細胞活性的影響進行了初步的探討,并為建立候選化合物庫做前期準備。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

肝癌細胞系BEL-7404,SMMC-7721,和肝正常細胞系QSG-7701均由本實驗室保存。本實驗所用的細胞都使用含10%FBS的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養(yǎng)基,并且在5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM購自GIBCO公司,FBS購自BioChrom公司。5-FU,依托泊苷,阿霉素,順鉑,白藜蘆醇和甲硫噠嗪均購自Sigma公司。

二氧化碳培養(yǎng)箱型號為BBG16UV151L,Heraeus;倒置顯微鏡型號為Olympus,IX71-22FL/PH;酶聯(lián)免疫檢測儀/酶標儀型號為華運安特,DG5033A。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)和傳代

將兩株不同的肝癌細胞和肝正常細胞放在溫度為37℃,二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔兩天給細胞換新鮮的培養(yǎng)液,并且在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況。當細胞長滿時,進行傳代。確認沒有污染和細胞狀態(tài)良好后,將培液倒掉,加入2 mL的PBS洗1次,加入0.5 mL胰酶進行消化,輕輕搖動讓胰酶浸潤所有細胞,將細胞放入37℃消化3 min。待細胞變圓,彼此分離后,棄去胰酶,加入有血清的培液終止消化。接著,用槍把細胞吹散均勻,使之盡量分散成單個細胞。一部分細胞用于實驗,一部分細胞用于傳代,多余的細胞則廢棄。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力

將狀態(tài)良好單細胞按5×103個/孔植入96孔板中培養(yǎng),待細胞貼壁后,加入經(jīng)過稀釋的藥物,培養(yǎng)48 h。之后加入MTT溶液,使MTT在細胞溶液中的最終濃度為5 mg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng),加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解。接著,用酶聯(lián)免疫檢測儀于595 nm和650 nm處檢測隔空的吸光值。

1.2.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)的表現(xiàn)為平均值加減標準差,它們之間差異的顯著性是用Student’sttext。當P<0.05時,認為差異顯著。

2 結 果

2.1 基因毒性類化合物對肝癌細胞和肝正常細胞的細胞活性的影響

圖1(a)所示,隨著阿霉素的濃度的增加,肝癌細胞BEL-7404和SMMC-7721的細胞活性顯著下降,其對肝癌細胞BEL-7404的IC50值為0.25 μg/mL,對肝癌細胞SMMC-7721的IC50值為0.60 μg/mL。同時對比肝正常細胞QSG-7701,隨著阿霉素濃度升高,肝正常細胞QSG-7701的細胞活性也會產(chǎn)生一定的影響,IC50值為5 μg/mL。這表明阿霉素是一種潛在的治療肝癌的化合物。而其他的化合物,隨著濃度的增加,5-FU對兩種肝癌細胞的活性影響都不高,反而對肝正常細胞的活性影響更高;順鉑幾乎對兩種肝癌細胞的活性沒有影響,反而對肝正常細胞有著一定的影響;依托泊苷,在殺傷肝癌細胞的同時也對肝正常細胞的細胞活性造成很大的影響。(圖1(b)-(d))。

圖1 基因毒性化合物對肝癌細胞和肝正常細胞的作用注:(a)用不同濃度的阿霉素處理BEL-7404,SMMC-7721和QSG-7701后48 h用MTT檢測細胞活性。(b)-(d)在和(a)同樣的條件下,分別使用不同濃度的5-FU,順鉑和依托泊苷對細胞進行處理后用MTT檢測細胞活性的影響。藥物濃度如圖1中所示。

2.2 白藜蘆醇和甲硫噠嗪對肝癌細胞和肝正常細胞的細胞活性的影響

如圖2(a)所示,當白藜蘆醇的濃度小于或等于200 μM時,對兩種肝癌細胞和肝正常細胞的細胞活性影響不明顯;當濃度達到1 000 μM時,對肝癌細胞BEL-7404的細胞活性影響很大,能夠抑制80%的細胞的細胞活性,其對肝癌細胞BEL-7404的IC50值約為600 μM;對肝癌細胞SMMC-7721的細胞活性也有一定的影響;但是,對肝正常細胞的細胞活性幾乎沒有影響。甲硫噠嗪對肝癌細胞活性的影響與白藜蘆醇相似,當甲硫噠嗪的濃度達到50 μM,能夠抑制約為90%的肝癌細胞BEL-7404和SMMC-7721的細胞活性,IC50值都為20 μM;但是,對肝正常細胞的細胞活性幾乎沒有影響。

圖2 白藜蘆醇和甲硫噠嗪對肝癌細胞和肝正常細胞的細胞活性的影響注:(a)用不同濃度的白藜蘆醇處理BEL-7404,SMMC-7721和QSG-7701之后48 h,MTT法檢測細胞活性。(b)BEL-7404,SMMC-7721和QSG-7701細胞用不同濃度的處理之后48 h,通過MTT檢測細胞活性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

3 討 論

隨著人們生活水平的提高,平均壽命大大延長,曾經(jīng)嚴重影響人類健康的的天花、鼠疫等疾病漸漸被消滅,但是由人類自身所引起的癌癥的發(fā)病率卻日益升高,死亡人數(shù)也逐年上升。在當今社會,癌癥已經(jīng)嚴重威脅著人類的健康。篩選出具有顯著療效的化療藥物,已經(jīng)刻不容緩?；衔飳毎钚缘挠绊懹兄煌姆肿訖C制。有的是抑制DNA的合成,有的是導致DNA的斷裂[7-11],還有的是抑制蛋白質(zhì)的合成[12-15]。理想的化療藥物是這種化合物能夠大部分或者完全抑制腫瘤細胞的細胞活性,而對正常的細胞的細胞活性沒有影響或者影響較小。利用體外培養(yǎng)的腫瘤細胞和正常的細胞體系對單一或者多種化合物的評價是化療藥物篩選的最開始的一部分。通過這種方法可以篩選出對某種或者某幾種的腫瘤細胞的細胞活性有較大影響的化合物。然后進一步的實驗可以從中篩選出可以應用于臨床的化療藥物。

在本實驗中,分析了6種化合物在不同濃度的狀態(tài)下對兩種肝癌細胞和肝正常細胞的細胞活性的影響。MTT細胞活性實驗表明,白藜蘆醇和甲硫噠嗪符合化療藥物篩選的最基本要求,即在某種的藥物濃度下,可以絕大部分抑制肝癌細胞的細胞活性,并且對正常肝細胞的細胞活性影響較小,這表明它們是兩種很好的潛在的抗腫瘤活性的小分子化合物。

總之,筆者利用體外肝癌細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點,初步的探討了6種化合物的抗癌潛能,為建立抗癌化合藥物候選庫做了前期的探索。為進一步的驗證及動物和臨床實驗提供了依據(jù)。

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(責任編輯：許惠兒)

Comparison of Effects of Six Chemical Compounds on Activity of Liver Cancer Cell

ZHOUChi-kai,PANQiang

(Xinyuan Institute of Medicine and Biotechnology,School of Life Science, Zhejiang Sci-Tech University,Hangzhou 310018,China)

Liver cancer in the world,especially in China,has a high morbidity.In China,about 40 people suffer from liver cancer in almost every 100,000 people.For the treatment of liver cancer,the most common ways include operation treatment and chemotherapy.The effects of different chemical compounds on cell activity of different cancer cells are greatly diverse.To compare the effects of different chemical compounds on cell activity of different cancer cells,the authors did the following experiments.MTT was used to detect influences of 6 common compounds with different concentrations (doxorubicin,cisplatin,etoposide,5-FU,thioridazine and resveratrol) on cell activity of liver cancer cells.The results show that the values of IC50 are 0.25 μg/mL (doxorubicin),20 μg/mL (etoposide),500 μM (thioridazine) and 20 μM (resveratrol).With certain concentration range,as doxorubicin concentration rises,activity of liver cancer cells drops significantly.Besides,the activity of normal liver cells declines to some extent.As etoposide concentration rises,activity of both liver cancer cells and normal liver cells drops obviously.As thioridazine concentration rises,activity of liver cancer cells falls obviously,and activity of normal liver cells is almost not influenced.

live cancer; cell; chemotherapy; chemical compounds; cell activity

1673-3851 (2015) 02-0249-04

2014-03-13

浙江理工大學科研啟動基金(1204807-Y);上海市自然科學基金(13ZR1446300)

周馳凱(1989-),男,江西九江人,碩士研究生,主要從事胚胎發(fā)育和腫瘤靶向治療方面的研究。

潘 強,E-mail:loveqiang@126.com

Q255

A