董藝凝,陳海琴,張 灝,陳 衛(wèi)

(1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽滁州 239000;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

嗜熱脂肪芽孢桿菌耐熱β-半乳糖苷酶功能位點(diǎn)的累積進(jìn)化研究

董藝凝1,陳海琴2,*,張 灝2,陳 衛(wèi)2

(1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,安徽滁州 239000;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122)

針對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillusstearothermophilus)來源耐熱β-半乳糖苷酶BgaB底物結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建突變體,研究底物結(jié)合位點(diǎn)累積突變的功能進(jìn)化及水解活性的變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Y272A與E351R的累積突變體比酶活為野生型酶的3.67倍,為單點(diǎn)突變體Y272A的2倍;Y272A/E351R突變體的Km值增大,其對(duì)乳糖的親和力下降,但由于Kcat值增大,使累積突變體Y272A/E351R催化效率提高為野生型酶催化效率的7.8倍。本研究結(jié)果表明底物結(jié)合位點(diǎn)間的累積突變可改變底物親和性,并對(duì)水解催化活性進(jìn)化起到正向促進(jìn)作用。

β-半乳糖苷酶,嗜熱脂肪芽孢桿菌,累積進(jìn)化,功能位點(diǎn)

β-半乳糖苷酶(β-d-galactoside galactohydrolase,EC 3.2.1.23)可以水解β-1,4-糖苷鍵,乳品工業(yè)用其水解乳糖生產(chǎn)低乳糖奶,以及利用β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷活性合成低聚半乳糖(GOS)。嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶BgaB屬于GH42家族,該家族β-半乳糖苷酶具有耐熱、耐鹽、耐酸以及耐堿等催化特性,但其對(duì)底物乳糖的利用效率普遍較低。因此,針對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌來源的耐熱β-半乳糖苷酶BgaB功能進(jìn)化及氨基酸位點(diǎn)的研究,可更好的改造β-半乳糖苷酶在特殊生產(chǎn)環(huán)境下的適應(yīng)性。

自然界在進(jìn)化過程將有益突變保留并累積以強(qiáng)化蛋白質(zhì)功能[1-2]。人們?cè)趯?shí)驗(yàn)室環(huán)境下模擬自然進(jìn)化過程,通過采用蛋白質(zhì)或基因工程技術(shù),包括易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)突變以及點(diǎn)飽和突變等基因擴(kuò)增技術(shù),對(duì)酶分子進(jìn)行功能改造。在獲得功能優(yōu)化的單點(diǎn)突變體基礎(chǔ)上,進(jìn)行不同功能氨基酸位點(diǎn)間的多點(diǎn)突變,可以使蛋白質(zhì)功能獲得進(jìn)一步改善及“累積”[3-5]。如Cervelli M等[6],通過對(duì)活性口袋中底物結(jié)合位點(diǎn)的累積突變(E216L/S218A 和E216T/S218A)使spermine oxidase進(jìn)化獲得N1-acetylspermine oxidase activity?？聺萚7]利用重疊延伸法對(duì)嗜熱球菌Thermococcussp.的高溫酸性α-淀粉酶基因BD5088進(jìn)行體外A154C/G155C雙點(diǎn)定點(diǎn)突變,酶學(xué)性質(zhì)分析表明,突變淀粉酶拓寬了反應(yīng)pH范圍,尤其是酸性條件下提高更為顯著。在前期研究中,筆者對(duì)耐熱β-半乳糖苷酶BgaB底物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)及功能改造,并獲得了功能進(jìn)化的單點(diǎn)突變體[8]。為了探索這些位點(diǎn)間協(xié)同進(jìn)化規(guī)律,底物親和性變化特點(diǎn),進(jìn)而開展了本項(xiàng)研究,探討β-半乳糖苷酶功能氨基酸位點(diǎn)間累積進(jìn)行對(duì)酶功能的影響。

表2 定點(diǎn)突變引物核酸序列

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒Escherichiacoli(E.coli)JM109(recA1,supE44,endA1,hsdR17,gyrA96,relA1,thi,([lac-proAB]F’[traD36,proAB+,lacIq,lacZΔM15]),DH5α(supE44ΔlacU169hsdR17(Φ80lacZΔM15)RecA1endA1gyrA96thi-1relA1);質(zhì)粒載體pKK223-3均由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種庫(kù)(Culture Collection of Food Microorganisms,Jiangnan university CCFM)提供。

1.1.2 主要試劑及儀器設(shè)備 氨芐青霉素(Amp) 購(gòu)自上海生工;限制性內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶,Taq DNA聚合酶 購(gòu)自Takara公司;KOD plus高保真DNA聚合酶 購(gòu)自Toyobo公司;DpnI 購(gòu)自Fermentas公司;DNA瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;PCR產(chǎn)物純化試劑盒 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒 購(gòu)自北京莊盟生物基因科技有限公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;鎳親和柱(Ni-Chelaing Column) Qingen公司。

GS00001PCR儀 英國(guó)G-STROM公司;5415R/5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Power pac核酸電泳儀 Bio-Rad Laboratories;Basic 041BR蛋白質(zhì)電泳儀 Bio-Rad Laboratories;Geldoc 2000凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad Laboratories;SpectraMax M5/M5e微孔板檢測(cè)系統(tǒng) Molecular Devices;UV-2100可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司;MK3酶標(biāo)儀 Thermo公司;VCX500超聲波破碎儀 SONICS&MATERIALS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 累積突變體設(shè)計(jì) 本文在已有研究基礎(chǔ)上,將BgaB的不同功能進(jìn)化的單點(diǎn)突變體進(jìn)行突變累積研究,以進(jìn)一步探討及功能變化及作用機(jī)制。累積突變?cè)O(shè)計(jì)如表1所示。

表1 累積突變實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.2 累積突變體的構(gòu)建 以構(gòu)建質(zhì)粒pKK223-3-bgaB的單點(diǎn)突變體(R109W,E351R)為模板,采用快速全質(zhì)粒擴(kuò)增突變法(QuickChange? site-directed mutagenesis protocol)針對(duì)選擇位點(diǎn)引入累積位點(diǎn)突變體。三位點(diǎn)累積突變以構(gòu)建雙點(diǎn)突變體為模板。引物設(shè)計(jì)如表2。

1.2.3 野生型及突變酶的表達(dá)及純化 以JM109作為宿主,pKK223-3作為表達(dá)載體對(duì)野生型及突變酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。菌體破壁后將破胞液55℃熱處理30min去除不耐熱的雜蛋白后,12000r/min離心20min收集上清,即得粗酶液。經(jīng)鎳親和柱(Ni-Chelating Column)純化,然后用50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)透析除去咪唑,再用聚乙二醇包埋濃縮制得純化酶蛋白樣品。

1.2.4 β-半乳糖苷酶活性測(cè)定 按中性乳糖酶酶活檢測(cè)方法(Gist-Bracades法)[9]。以鄰硝基苯β-d-半乳吡喃糖苷(oNPG)為底物,一個(gè)中性乳糖酶單位定義為:在pH6.5條件下,每分鐘水解產(chǎn)生1μmol的oNP所需的酶量為一個(gè)中性乳糖酶活單位(NLU或U)。對(duì)嗜熱脂肪芽孢桿菌源酶及其重組酶,反應(yīng)溫度定為55℃。

1.2.5 最適反應(yīng)pH 配制不同pH的磷酸鹽緩沖液,并用相應(yīng)的緩沖液溶解底物oNPG,在最適反應(yīng)溫度下按中性乳糖酶酶活檢測(cè)方法(Gist-Bracades法)測(cè)定相對(duì)酶活。

1.2.6 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定 配制oNPG濃度0.1～15mmol/L,在50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0),55℃條件下測(cè)定酶反應(yīng)初速度。采用Lineweaver-Burk法對(duì)1/V-1/[S]作圖,根據(jù)兩軸上的截距求得Km值(x軸截距負(fù)倒數(shù))與Vmax(y軸截距倒數(shù)),再由Vmax=kcat*[E]計(jì)算求出kcat;半乳糖抑制實(shí)驗(yàn)為在酶活測(cè)定反應(yīng)體系中加入不同濃度半乳糖(0～200mmol/L),以Linweaver-Burk 作圖法求Ki。

1.2.7 β-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性測(cè)定 將酶溶解于20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中,不同溫度下保溫一定時(shí)間后,取出迅速冷卻,室溫平衡后按1.2.4方法測(cè)定酶活。半衰期的測(cè)定方法為將野生型及突變體純化酶置于70℃水浴保溫,每間隔5min取樣迅速置冰水中冷卻。在最適反應(yīng)溫度條件下測(cè)定酶活。以未經(jīng)熱處理,最適反應(yīng)溫度下測(cè)得酶活100%,不同時(shí)間熱處理后保留酶活對(duì)時(shí)間作圖,求得野生型及突變體酶半衰期。

1.2.8 β-半乳糖苷酶BgaB結(jié)構(gòu)模擬分子 結(jié)構(gòu)模擬采用同源建模法,以同源家族晶體結(jié)構(gòu)A4-β-Gal為模板(PDB:1kwk),采用在線建模服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建BgaB分子模擬結(jié)構(gòu)。利用AutoDock軟件對(duì)底物結(jié)合模式進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)與分析

耐熱β-半乳糖苷酶以其良好的熱穩(wěn)定性,及適宜高溫度條件下乳糖水解的特性,使之具有常溫乳糖酶所不具有的催化優(yōu)越性。但是由于其對(duì)乳糖的水解活性較低,限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。在之前的研究中,通過同源序列比對(duì)預(yù)測(cè)了參與耐熱β-半乳糖苷酶BgaB底物結(jié)合的位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)可能參與底物結(jié)合的位點(diǎn)包括Arg109,Asn147,Try272,Trp311,Phe341,Glu351和His354(如圖1)。并針對(duì)所有位點(diǎn)構(gòu)建了飽和突變體文庫(kù),通過突變體庫(kù)的篩選,獲得了乳糖水解活性提高的單點(diǎn)突變體E351R,Y272A和R109W。

圖1 β-半乳糖苷酶BgaB與乳糖和半乳糖分子結(jié)合位點(diǎn)模型Fig.1 The binding modes of the lactose and galactose in the active site of BgaB注:A-乳糖結(jié)合位點(diǎn)示意圖;B-半乳糖結(jié)合位點(diǎn)示意圖。

2.2 累積突變?cè)O(shè)計(jì)及粗酶活分析

以本研究前期工作已經(jīng)構(gòu)建的單點(diǎn)突變酶基因?yàn)槟０?采用全質(zhì)粒擴(kuò)增方法在酶基因序列上引入突變,所有累積突變體擴(kuò)增得到大小為5000bp左右的條帶(如圖2),符合全質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

圖2 耐熱β-半乳糖苷酶BgaB累積突變體全質(zhì)粒擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoresis of thermostable β-galactosidase BgaB cumulative mutagenesis by plasmid amplification注:1-pKK223-3-bgaB;2-R109W/E351R;3-Y272A/E351R;4-R109W/Y272A;5-R109W/Y272A/E351R. M-DNA Marker。

96孔板粗酶活比較結(jié)果如圖3所示,相對(duì)于野生型酶活性提高的突變有Y272A/E351R。但是其中R109W/Y272A和R109W/E351R活性相對(duì)野生型酶及單點(diǎn)突變體,其反應(yīng)體系吸光值均有不同程度下降,表明其酶活下降,而累積突變體R109W/Y272A/E351R未檢測(cè)到405nm處吸光值。由于采用酶反應(yīng)體系吸光值靈敏度受到表達(dá)量影響較大,故對(duì)突變體酶進(jìn)行純化分析。

圖3 突變酶與野生型酶粗酶活比較Fig.3 Comparative of the crude enzyme activity of mutants and wild-type enzymes

2.3 累積突變體水解活性分析

為了研究累積突變體酶的催化特性,首先對(duì)累積突變體R109W/Y272A,R109W/E351R,Y272A/E351R和R109W/Y272A/E351R進(jìn)行蛋白純化(如圖4)。突變體酶與野生型相比,蛋白分子量大小相同均為70ku。分別對(duì)純化突變體酶進(jìn)行比酶活、最適pH及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定。

圖4 野生型及累積突變體酶SDS-PAGE分析Fig.4 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)analysis of the purified wild-type and mutant enzymes.注:1-野生型酶;2-R109W/Y272A;3-R109W/E351R;4-Y272A/E351R;5-R109W/Y272A/E351R；M:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)marker。

2.3.1 突變體比酶活變化分析 累積突變體比酶活分析結(jié)果如表3所示,R109,Y272和E351三個(gè)位點(diǎn)累積突變體中,雙點(diǎn)突變體Y272A/E351R比酶活最高,為野生型酶比酶活的3.67倍,分別是單點(diǎn)突變體Y272A的2.1倍,是R109W突變體比酶活的3倍。雙點(diǎn)突變R109W/Y272A和R109W/E351R的比酶活小于單點(diǎn)突變體,并下降為野生型酶比酶活的76%和68%。其中,單點(diǎn)突變體E351R是經(jīng)定向進(jìn)化篩選所得比酶活提高最多的突變體,其比酶活為野生型的3.5倍。其次是Y272A突變體比酶活為野生型酶的1.8倍。R109W是Arg109位點(diǎn)突變體庫(kù)中篩選得到的最優(yōu)突變,其比酶活比野生型提高了1.2倍。比酶活比較結(jié)果顯示,雙位點(diǎn)累積突變體酶活相對(duì)野生型及單位點(diǎn)突變體酶活變化呈提高和下降兩種變化,但R109W/Y272A/E351R累積突變體酶失活。

表3 野生型及突變酶比酶活分析

注:N.D.-未檢測(cè)到活性。

2.3.2 最適pH的變化 雙點(diǎn)突變體最適作用pH與野生型酶及對(duì)應(yīng)單點(diǎn)突變體比較結(jié)果如圖5所示。突變體R109W/E351R最適pH為7.5,與單點(diǎn)突變體E351R相同,二者最適作用pH條件均相對(duì)野生型酶(pH7.0)及單點(diǎn)突變體R109W(pH 7.25)向堿性條件偏移(圖5-A);雙點(diǎn)突變R109W/Y272A相對(duì)野生型酶最適pH向酸性條件發(fā)生偏移,但與單點(diǎn)突變體Y272A最適pH相同均為6.75(圖5-B)。雙點(diǎn)突變體Y272A/E351R的最適pH介于單點(diǎn)突變Y272A(pH6.75)和單點(diǎn)突變體E351R(pH7.5)之間,相對(duì)野生型最適pH向堿性條件偏移(圖5-C)。

通過與GH42家族A4-β-Gal晶體結(jié)構(gòu)比較分析,發(fā)現(xiàn)BgaB的底物結(jié)合位點(diǎn)Arg109和Glu351位點(diǎn)均位于BgaB的活性口袋內(nèi),分別參與底物半乳糖基C3,C4結(jié)合(如圖6)。Tyr272位點(diǎn)雖然未在結(jié)構(gòu)模擬中分析到它的結(jié)合能,即該位點(diǎn)沒有直接通過氫鍵作用參與底物結(jié)合,在同家族酶A4-(-gal結(jié)構(gòu)中,與其對(duì)應(yīng)的Tyr266和被認(rèn)為具有調(diào)控催化氨基酸Glu312位點(diǎn)pka的功能[10]。本項(xiàng)研究中Tyr272位點(diǎn)的突變也改變了BgaB的最適作用pH條件,表明Tyr272位點(diǎn)(以BgaB氨基酸序列編碼)可能在GH42家族糖苷水解酶中起到調(diào)控pH的作用,因此在催化過程中不可缺失。Arg109位點(diǎn)及Glu351氨基酸位點(diǎn)的改造及累積突變對(duì)pH的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

圖5 野生型、單點(diǎn)突變體及累積突變體最適pHFig.5 The optimum pH of the willd-type,single mutation and double mutation注:A-R109、E351雙點(diǎn)突變體最適pH;B-R109、Y272雙點(diǎn)突變體的最適pH;C-Y272、E351雙點(diǎn)突變體最適pH。

圖6 耐熱β-半乳糖苷酶BgaB分子結(jié)構(gòu)及底物結(jié)合位點(diǎn)模擬Fig.6 Homology model of the thermostable β-galactosidase BgaB and substrate binding注:A-耐熱β-半乳糖苷酶BgaB與底物結(jié)合示意圖;B-參與半乳糖分子結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)示意圖。

表4 野生型及突變酶水解oNPG和乳糖反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3.3 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析 累積突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果及與野生型、單點(diǎn)突變體的比較如表4。以oNPG作為底物時(shí),累積突變體R109W/E351R,R109W/Y272A和Y272A/E351R與野生型酶相比km值均增大。表明雙點(diǎn)突變對(duì)底物的親和力有所下降,但累積突變體轉(zhuǎn)換常數(shù)kcat相對(duì)野生型變大。Y272A/E351R的催化效率(kcat/Km)高于單點(diǎn)突變體酶Y272A,E351R及野生型酶,是野生型酶催化效率的5倍。由此可以看出,雙點(diǎn)突變Y272A/E351R的底物親和力有所下降,但kcat的提高最終促進(jìn)催化效率的提高增大。Arg109位點(diǎn)與Glu351位點(diǎn)的累積突變沒有進(jìn)一步提高催化效率,R109W/E351R和R109W/Y272A的催化效率相對(duì)野生型及單點(diǎn)突變均變小,這可能主要是由于底物親和力顯著降低造成的。

以乳糖為底物的動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果表明,Y272A/E351R相對(duì)野生型km值變大,對(duì)乳糖的親和力下降。但由于kcat值同時(shí)增大,使累積突變體Y272A/E351R催化效率相對(duì)野生型和單點(diǎn)突變體均有所提高,為野生型酶催化效率的7.8倍。這表明Y272A/E351R對(duì)乳糖和oNPG為底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化規(guī)律一致,累積突變可以使催化效率相對(duì)單點(diǎn)突變獲得提高。累積突變體R109W/E351R以乳糖和oNPG為底物的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)相對(duì)野生型的變化規(guī)律有所不同。雖然,R109W/E351R以oNPG為底物的催化效率相對(duì)野生型及單點(diǎn)突變均有所下降,但以乳糖為底物時(shí),R109W/E351R相對(duì)野生型酶其Km值變小、kcat值增加。表明R109W/E351R突變體對(duì)乳糖的親和力增加,反應(yīng)速率增大,且催化效率提高為野生型酶的2倍。累積突變體R109W/E351R對(duì)不同底物催化效率發(fā)生改變的現(xiàn)象也表明,累積突變可能影響了底物的選擇性。

2.4 累積突變體穩(wěn)定性分析

對(duì)雙點(diǎn)突變的熱穩(wěn)定性研究結(jié)果,如圖7所示。70℃下雙點(diǎn)突變體與野生型酶的熱失活進(jìn)程曲線相似,表明影響活性的Arg109,Try272及Glu351位點(diǎn)間累積突變后,未改變酶的穩(wěn)定特性。從單點(diǎn)突變體與雙點(diǎn)突變的最適作用溫度比較還可以發(fā)現(xiàn),野生型酶及雙點(diǎn)突變體最適作用溫度均為55℃(如圖8)。其中,Y272A/E351R突變體酶活在不同溫度條件下,比酶活均高于野生型酶。綜合以上研究結(jié)果可知,R109W/E351R,R109W/Y272A以及Y272A/E351R突變體均未改變酶的熱穩(wěn)定性。該結(jié)果表明BgaB 功能位點(diǎn)間的累積突變不影響酶的穩(wěn)定特性及最適作用溫度。

圖7 野生型及突變體酶熱失活過程(70℃)Fig.7 Thermal inactivation curves of wild-type and mutants(70℃)

圖8 野生型及突變酶比酶活的溫度變化圖Fig.8 Specific activity of wild-type and mutants over temperature

3 結(jié)論

通過對(duì)突變體比酶活及酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析表明,底物結(jié)合位點(diǎn)間的累積突變可以導(dǎo)致酶對(duì)底物親和力發(fā)生變化,進(jìn)而影響了酶的催化活性。這一研究結(jié)果說明,底物結(jié)合模式是影響底物親和特異性及催化特性關(guān)鍵因素。本研究中,底物結(jié)合位點(diǎn)間的累積進(jìn)化,可對(duì)酶的催化活性產(chǎn)生兩種相反的改變,包括比酶活提高和比酶活的降低。但累積突變對(duì)于酶的催化活性影響產(chǎn)生負(fù)作用的可能性要大于其對(duì)酶功能的正向促進(jìn)作用,且三點(diǎn)累積突變體可導(dǎo)致酶失活。說明功能位點(diǎn)耐受突變的程度有限,這一結(jié)果符合自然進(jìn)化規(guī)律,即酶的催化位點(diǎn)都具有嚴(yán)格的保守性[11-12]。其原因可能在于保守氨基酸位點(diǎn)的突變及累積突變所帶來的功能改變大多對(duì)于酶的催化特性而言是不利的[13]。但同時(shí),對(duì)功能位點(diǎn)的改造可以實(shí)現(xiàn)酶的快速功能進(jìn)化。參與底物結(jié)合位點(diǎn)間作用關(guān)系的揭示也將有助于蛋白質(zhì)功能的改造和催化機(jī)制的完善。本研究結(jié)果也同時(shí)表明了,對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)間位點(diǎn)的累積突變,是一種提高β-半乳糖苷酶功能進(jìn)化的高效策略。但氨基酸位點(diǎn)間的相互影響及作用關(guān)系十分復(fù)雜,對(duì)這種復(fù)雜變化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步深入探討。

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Coevolutionary study on the functionary amino acid residues ofGeobacillusstearothermophilusthermostable β-Galactosidase BgaB

DONG Yi-ning1,CHEN Hai-qin2,*,ZHANG Hao2,CHEN Wei2

(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Chuzhou University,Chuzhou 239000,China;2. Shool of Food Science and Technology,State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

To study the coevolutionary of the functional residues and the variation of hydrolysis activity,the substrates binding residues simultaneous mutations ofGeobacillusstearothermophilusthermostable β-galactosidase were constructed. The results showed that the Y272A/E351R simultaneous mutant let a 3.67-fold increase in specific activity over the wild type enzyme and give a 2-fold increase over the single site mutation Y272A. Increased Km value of Y272A/E351R mutant occurred with decreased affinity of lactose binding,while the mutant increased the catalytic efficiency of the wild type enzyme by 7.8-fold. This study revealed that the simultaneous evolution of the substrate binding residues had its advantage on substrate affinity,and was favorable to the evolution of catalytic activity.

β-galactosidase;Geobacillusstearothermophilus;simultaneous evolution;functional residues

2014-06-16

董藝凝(1980-)，女，博士，研究方向：酶的功能進(jìn)化。

*通訊作者:陳海琴(1978-)，女，博士，教授，研究方向：食品微生物功能發(fā)掘與利用。

國(guó)家青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31301523)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31171636)；十二五國(guó)家“863”計(jì)劃(2011AA100905)；安徽高校省級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目(KJ2013B187)；滁州學(xué)院科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(2012qd14)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0148-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.023