王士苗,康文藝,孫 麗,周俊國,李新崢,*

(1.河南科技學院園藝園林學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南大學藥學院,河南開封 475000)

25個南瓜品種不同溶劑提取物抗氧化活性研究

王士苗1,康文藝2,孫 麗1,周俊國1,李新崢1,*

(1.河南科技學院園藝園林學院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.河南大學藥學院,河南開封 475000)

采用清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、清除[2,2′-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽](ABTS)自由基以及鐵離子還原能力(FRAP)的方法,以BHT為陽性對照藥物,研究25個南瓜品種的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:南瓜提取物清除DPPH自由基能力均較弱;“汕美2號”乙酸乙酯清除ABTS自由基(IC50=(4.41±0.23)μg/mL)能力最強,強于陽性對照BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL);對于還原Fe3+能力,乙酸乙酯提取物高于其他部位提取物,其中“改良蜜本”乙酸乙酯部位(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)的還原能力弱于陽性對照Trolox(TEAC=(1387.51±37.93)μmol/g)。

南瓜果實,體外抗氧化,DPPH,ABTS,FRAP

正常機體中自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動態(tài)平衡中,但在自由基產(chǎn)生過多或抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱時,體內(nèi)自由基則不能被完全清除而累積進而損害機體,導致一系列相關(guān)疾病,抗氧化劑可以抑制自由基的產(chǎn)生或直接清除自由基。目前食品和醫(yī)學領(lǐng)域應用的人工合成抗氧化劑如BHT、BHA等有諸多副作用。因此,近年來從自然界中尋求天然、安全抗氧化劑已引起研究人員的高度重視。

表1 南瓜序號與品種、類型、來源

關(guān)于南瓜的研究多集中于水溶性多糖成分上,且實驗用所南瓜材料大都是隨機選取,且只選擇某個品種或少量幾個品種[14-17],本實驗對25種中國南瓜和日本南瓜品種石油醚、乙酸乙酯、甲醇提取物抗氧化能力進行綜合考察,具有品種廣泛性和代表性,以期為南瓜抗氧化活性研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜 為河南科技學院南瓜實驗基地種植的25個南瓜品種及組合,包括中國南瓜(CucurbitamoschtaDuch.)和印度南瓜(CucurbitamaximaDuch.),詳見表1。2013年3月30日浸種催芽,4月3日播種育苗,4月15日定植。采用隨機區(qū)組設(shè)計,每個品種設(shè)3次重復,共15個小區(qū),每個小區(qū)種3畦,每畦種植2行。采樣時從每個小區(qū)中選取3個成熟度一致具有該品種代表性狀的果實,在生育期采用常規(guī)的栽培管理措施,于2013年7～8月間取材,并經(jīng)過后熟和貯藏,在9～10月份進行測定分析。

二苯代苦味酰基自由基(DPPH) 東京化成工業(yè)株式會社;ABTS 德國Fluka公司;6-三吡啶基三嗪(TPTZ)及二丁基羥基甲苯(BHT) 均購自比利時Across Organics公司;Trolox(6-hydroloxy-2,5,7,8-tetram-ethylchroman-2-carboxylicaci) 美國Sigma-Aldrich公司;其余試劑均為分析純。

Multiskan MK3型酶標儀 美國Thermo Electron公司;電子天平 美國Mettler-Toledo公司;N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物樣品的制備 南瓜果實洗凈去瓤去籽,陰干粉碎后依次用石油醚、乙酸乙酯和甲醇依次加熱提取各兩次,溫度以溶液微沸為宜,每次1h,過濾合并濾液,真空濃縮后分別得到石油醚提取物(PE)、乙酸乙酯提取物(EA)、甲醇提取物(ME)三個部位提取物。

1.2.2 提取物體外抗氧化活性篩選方法

1.2.2.1 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基法 各提取物用甲醇溶液溶解,配制2.0mg/mL的樣品溶液,并參照文獻[18]的方法配制200μmol/L的DPPH溶液。在96微孔板中加入10μL樣品溶液和175μL DPPH溶液,混合均勻,室溫條件下暗反應20min后于515nm下測定其吸光值。每份樣品平行測定3次,求均值并按照下式計算樣品清除率。樣品溶液對DPPH自由基清除率高于50%的樣品依次往下稀釋四個濃度,并依次計算清除率。

清除率(%)=[(A對照-A樣品)/A對照]×100

式中,A對照為DPPH本身在測定波長處的A值;A樣品為樣品溶液對DPPH自由基作用后的A值(除去樣品自身吸收)。

計算得到的清除率,運用Origin7.5軟件處理,得到樣品清除DPPH自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)。

1.2.2.2 清除[2,2′-聯(lián)氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二氨鹽](ABTS)自由基法 參照[19]方法配制ABTS工作液,96微孔板中加入10μL樣品溶液和200μL工作液,混合均勻,室溫下暗反應20min,在405nm處測定吸光值,10μL甲醇為對照。每份樣品平行重復3次,計算均值。樣品清除率按下式計算。初篩活性高于50%樣品依次往下稀釋四個濃度,并依次計算清除率。

清除率(%)=[(A對照-A樣品)/A對照]×100

式中,A對照為ABTS本身在測定波長處的A值;A樣品為樣品溶液對ABTS自由基作用后的A值(除去樣品自身吸收)。

根據(jù)計算得到的清除率,運用Origin 7.5軟件處理,計算樣品清除ABTS自由基的半數(shù)清除濃度(IC50)。

1.2.2.3 鐵離子還原法/抗氧化總能力測定法(FRAP法) 參照文獻[20]的方法配制TPTZ工作液:0.3mol/L醋酸鈉緩沖液、10mmol/L TPTZ溶液、20mmol/L FeCl3·6H2O三者體積比為10∶1∶1。首先繪制標準曲線,在96孔板中加入10μLTrolx溶液和200μLFRAP工作液,混合均勻,37℃條件下反應30min后在593nm處測定吸光度,分別以標準品Trolx濃度和吸光值為橫縱坐標繪制標準曲線。

測定樣品時在96孔板中加入10μL樣品溶液和配制好的200μL FRAP工作液,每份樣品重復3次,計算均值,結(jié)果以抗氧化當量(即每克樣品的自由基清除能力相當于Trolox的自由基清除能力的微摩爾數(shù)TEAC)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品對DPPH自由基的清除能力

南瓜不同溶劑提取物在初篩濃度為108.11μg/mL時,對DPPH自由基的清除率均小于50%。與陽性對照BHT(濃度為54.05μg/mL時清除率為60.12%)相比,各南瓜品種的提取物清除DPPH自由基的能力均較低。證明南瓜各部位提取物并無清除DPPH自由基的能力。(因為各樣品對DPPH自由基清除率均小于50%,無法計算其IC50,對DPPH自由基清除能力較弱,因此不再列表顯示。)

2.2 樣品對ABTS自由基的清除能力

南瓜提取物在初篩濃度95.24μg/mL時,多個南瓜品種乙酸乙酯部位提取物對ABTS自由基均有清除能力,表2列出了清除能力較好的幾個南瓜品種及部位和對應清除率。南瓜提取物中有清除ABTS自由基能力較好的大部分為乙酸乙酯提取部位,其中汕美2號南瓜EA(IC50=(4.41±0.23)μg/mL)、浙江七葉南瓜EA(IC50=(5.36±0.85)μg/mL)、改良蜜本南瓜EA(IC50=(7.78±0.61)μg/mL)抗氧化能力較好,且強于陽性對照BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL)。

圖1列舉了清除ABTS自由基能力較好的7個品種。由圖1可看出,在實驗濃度范圍內(nèi),隨著濃度升高,南瓜提取物對ABTS自由基清除率也逐漸升高。在濃度小于23.81μg/mL時,乙酸乙酯部位提取物對ABTS自由基清除率增長較快,超出這個范圍后,隨濃度升高,對ABTS自由基的清除率升高速度漸緩,至濃度大于47.62μg/mL后,隨濃度升高,樣品對ABTS自由基清除率不再變化,趨于穩(wěn)定。

圖1 不同品種南瓜提取物對ABTS自由基清除能力Fig.1 The extracts of different varieties pumpkins’ capacity in clear ABTS free radical ability

2.3 鐵離子還原能力/總抗氧化能力

表2列出了各提取物中鐵離子還原能力較高的幾個樣品及部位和對應的抗氧化當量值。由表可看出,南瓜提取物的Fe3+還原能力大小依次為:改良蜜本南瓜EA>汕美2號南瓜 EA>早熟京紅栗EA>百蜜2號EA>榛盆南瓜EA>九江轎頂南EA>靖邊南瓜EA,但它們的抗氧化能力都遠小于陽性對照Trolox(TEAC=(1387.51±137.93)μmol/g)。其中改良蜜本(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)、汕美2號(TEAC=(415.26±8.38)μmol/g)和早熟京紅栗(TEAC=(401.03±27.36)μmol/g)3個南瓜品種提取物的總抗氧化能力在25個南瓜品種中最高。

表2 不同品種南瓜提取物清除ABTS自由基的能力和TEAC值

3 結(jié)論與討論

目前測定體外抗氧化活性的方法較多,但大多是針對某一種自由基的清除活性,某一個方法的結(jié)果通常只代表樣品對某個自由基的清除能力。本實驗采用三種方法來衡量樣品的抗氧化活性。

DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,在517nm附近有較強的吸收,當自由基清除劑加入到DPPH溶液中時,DPPH的單電子被配對,在最大吸收波長處吸收顏色變淺,吸光值也有改變。ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑,經(jīng)活性氧氧化后生成一種穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基,若待測物中含有抗氧化物,則會與ABTS自由基發(fā)生發(fā)應而使反應體系顏色褪去。由Bnezie和Starni建立的FRAP法主要衡量樣品對Fe3+的還原能力,它反映的不是針對一種自由基的清除活性,而是樣品總的還原能力,DPPH和ABTS法均可通過在特定波長下吸光度的變化來評價自由基的清除情況,從而評價實驗樣品的抗氧化能力,抗氧化能力用清除率表示,清除率越大,抗氧化性越大,FRAP法測定結(jié)果抗氧化當量值可用于反映樣品總的抗氧化活性。

由結(jié)果看出,不同栽培品種南瓜的抗氧化活性不同,不同溶劑提取物之間的抗氧化性也有很大區(qū)別,本文采用的3種方法中,南瓜的3種不同溶劑提取物對DPPH自由基的抑制率力均較低,證明南瓜提取物還原DPPH自由基能力較差;ABTS法和FRAP法中,南瓜提取物初篩清除率大50%的樣品大部分都是乙酸乙酯(EA)部位提取物,證明南瓜的中等偏低極性成分對ABTS自由基有較好的清除能力,且總還原能力較強。

本實驗選取了的25種南瓜品種,主要包括了22種中國南瓜地方品種和3種日本南瓜,具有一定的廣泛性和代表性,其中改良蜜本南瓜、汕美2號南瓜提取物清除ABTS自由基能力和Fe3+還原能力高于其他品種,可結(jié)合其來源和品種進一步加以深入研究。

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Antioxidant activity of different solvent extracts from 25 kinds of cultivatedCucurbitaLinn. fruitsinvitro

WANG Shi-miao1,KANG Wen-yi2,SUN Li1,ZHOU Jun-guo1,LI Xin-zheng1,*

(1.School of Horticulture and Landscape Architecture,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China;2. School of Pharmacy,Henan University College,Kaifeng 475000,China)

This study was aimed to evaluate the antioxidant activity of 25 kinds of pumpkin extractioninvitro. The scavenging of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radicals and(2,2′-even the ammonia(3-ethyl benzene and thiazole-6-sulfonic acid)diamonium salt)(ABTS)radicals assay and ferric reducing capacity(FRAP)assay were used to measure the antioxidant activity of pumpkins. And BHT was used as the positive control drug. Results showed that the scavenging capability of DPPH free radical ability was weak. The ethyl acetate extract of Shanmei II showed the strongest power to clear ABTS radical(IC50=(4.41±0.23)μg/mL),better than that of BHT(IC50=(8.59±0.56)μg/mL). The power of ethyl acetate for reduction of Fe3+ability was higher than that of other extracts,and Gailiangmiben ethyl acetate extract(TEAC=(529.65±69.52)μmol/g)was weaker than that of Trolox(TEAC=(1387.51±37.93)μmol/g).

pumpkin fruit;antioxidantinvitro;DPPH;ABTS;FRAP

2014-05-19

王士苗(1989-),女,在讀碩士生,研究方向:蔬菜種質(zhì)資源研究與利用。

*通訊作者:李新崢(1965-),男,學士，教授,主要從事南瓜資源特性與開發(fā)利用研究。

河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃(2012IRTSTHN016)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)07-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.016