鄧 寬,李 娜,邵 闖,段 能,章望重,趙 萌

(湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430068)

威蘭膠中性蛋白酶法脫蛋白的研究

鄧 寬,李 娜,邵 闖,段 能,章望重,趙 萌*

(湖北工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部食品與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430068)

研究中性蛋白酶法制備低蛋白威蘭膠的最佳工藝及對(duì)威蘭膠樣品性質(zhì)的影響。本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定了中性蛋白酶對(duì)威蘭膠樣品的最優(yōu)除蛋白工藝。結(jié)果表明,當(dāng)威蘭膠濃度1%、溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g時(shí),水解威蘭膠樣品6h獲得65.3%的最高威蘭膠蛋白質(zhì)去除率;另外,比較了酶處理前后威蘭膠樣品的各組分含量和表觀粘度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),中性蛋白酶降低了威蘭膠樣品中的蛋白質(zhì)含量、提高了多糖含量,并保持了威蘭膠的高粘度特性。因而,中性蛋白酶法是制備低蛋白、高品質(zhì)威蘭膠產(chǎn)品的有效方法。

威蘭膠,脫蛋白,中性蛋白酶

威蘭膠(welan gum),是產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)發(fā)酵生產(chǎn)的一種胞外多糖[1-3],與結(jié)冷膠(gellan)、鼠李膠(rhamsan)、迪倫膠(diutan)共同構(gòu)成結(jié)冷膠家族(sphingans)[4]。其結(jié)構(gòu)骨架與結(jié)冷膠相同,為D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖組成的四糖片段,葡萄糖殘基的C3位連有側(cè)鏈(α-L-鼠李糖或α-L-甘露糖)[1]。威蘭膠是一種性質(zhì)優(yōu)良的假塑性流體,擁有耐高溫、耐酸堿、耐鹽等優(yōu)良特性[5-6],目前主要用于油墨[1]、混凝土[7]、石油[8]等工業(yè)生產(chǎn)中。1996年,日本厚生省首次將威蘭膠列入食品添加劑名單(No.120,April 16,1996),其在果汁、飲料、乳制品、果醬、烘焙食品、肉制品等食品中具有應(yīng)用價(jià)值。但目前商品化威蘭膠中殘留了大量蛋白質(zhì)和菌體[9],這是由于威蘭膠粘度高,生產(chǎn)過程中無法通過離心、過濾等物理方式除菌。若要將威蘭膠產(chǎn)品應(yīng)用于食品中,必須將其進(jìn)行脫蛋白處理,獲得低蛋白威蘭膠產(chǎn)品。

酶法脫除粘性多糖中的蛋白,不需添加高鹽或有機(jī)溶劑,操作簡(jiǎn)單、易于放大、綠色環(huán)保,是純化制備微生物胞外多糖的重要發(fā)展趨勢(shì)[10]。Wang等人采用堿性蛋白酶降解結(jié)冷膠中的蛋白,其蛋白質(zhì)降解率高達(dá)86%[11];歐文等人比較Sevage法、三氯乙酸法、木瓜蛋白酶法對(duì)薺菜多糖除蛋白的效果,結(jié)果表明,木瓜蛋白酶法除蛋白效果最佳[12]。目前,少量文獻(xiàn)報(bào)道了威蘭膠的菌種選育、發(fā)酵優(yōu)化等方面的研究[13-17],但威蘭膠脫蛋白研究未曾報(bào)道。本文嘗試采用中性蛋白酶降解威蘭膠中的蛋白質(zhì),同時(shí)不改變威蘭膠高粘度特性,獲得低蛋白、高品質(zhì)威蘭膠產(chǎn)品。

1 材料與方法

1. 1 材料與儀器

威蘭膠 河北鑫合生物化工有限公司;中性蛋白酶 諾維信公司,20000 U/mL;乙醇、福林酚試劑、苯酚、硫酸銅、硫酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉等試劑,均為分析純 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DTU-1900紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;F-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;旋轉(zhuǎn)流變儀Haake Rheostress 6000 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;GZX-9146 MBE數(shù)顯真空干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)公司醫(yī)療設(shè)備廠;SRT-202滾軸式混合器 海門市其林貝爾儀器制造公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫蛋白工藝 以20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液配制威蘭膠溶液,加中性蛋白酶,恒溫水浴鍋反應(yīng)6h,加入4倍乙醇靜置過夜,抽濾,真空干燥。將酶處理后的威蘭膠樣品溶脹,測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量及多糖含量,計(jì)算蛋白質(zhì)去除率及多糖回收率。在實(shí)驗(yàn)優(yōu)化過程中,首先采用單一因子變量法,控制其它反應(yīng)條件不變,改變反應(yīng)溫度(40、45、50、55、60℃)、pH(6、6.5、7、7.5、8)、酶底比(0.5、1.0、1.5、2、2.5mL/g)、威蘭膠濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%),研究各反應(yīng)條件對(duì)脫蛋白效果的影響。接著,采用正交實(shí)驗(yàn)法(如表1所示),進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 以牛血清蛋白為標(biāo)樣,Folin-酚法[18]測(cè)定威蘭膠中蛋白含量(500nm),計(jì)算蛋白質(zhì)去除率。蛋白去除率(%)=(蛋白質(zhì)去除前含量-蛋白去除后含量)/蛋白質(zhì)去除前含量×100。

1.2.3 多糖含量測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)樣,硫酸苯酚法[19]測(cè)定威蘭膠中多糖含量。

1.2.4 威蘭膠樣品粘度的測(cè)定 配制一定濃度的威蘭膠溶液,置于滾軸混合器上,速度適中混合12h。在HaakeRheoStress 6000旋轉(zhuǎn)流變儀上測(cè)定威蘭膠溶液粘度,使用P60 TiL轉(zhuǎn)子,測(cè)量間距設(shè)為1mm,實(shí)驗(yàn)溫度為25℃。穩(wěn)態(tài)剪切模式測(cè)定威蘭膠粘度,剪切速率設(shè)定為0.01～500s-1,對(duì)數(shù)模式采集數(shù)據(jù)點(diǎn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì),所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次并平行取樣。數(shù)據(jù)分析均采用SPSS17.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 中性蛋白酶制備低蛋白威蘭膠的條件優(yōu)化

2.1.1 溫度 酶的催化作用受溫度影響很大。與化學(xué)反應(yīng)一樣,提高溫度可以增加酶促反應(yīng)速度,但大多數(shù)酶是一種蛋白質(zhì),溫度過高會(huì)引起蛋白質(zhì)變性,導(dǎo)致酶的失活。固定威蘭膠濃度1%、pH7、酶底比為1mL/g,分別測(cè)定40、45、50、55、60℃時(shí)的蛋白質(zhì)降解率。由圖1可知:溫度對(duì)蛋白質(zhì)去除率影響巨大,當(dāng)溫度為50℃時(shí),威蘭膠樣品的蛋白質(zhì)去除率最高為63.7%,高于這個(gè)溫度后威蘭膠蛋白質(zhì)去除率急劇下降。因而,中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的最適反應(yīng)溫度是50℃,在諾維信公司提供的中性蛋白酶最適反應(yīng)溫度區(qū)間內(nèi)。

圖1 溫度對(duì)中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.1 The effect of temperature on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.1.2 反應(yīng)pH pH是影響酶催化效率的另一重要因素。酶只有在一定的pH范圍內(nèi)才表現(xiàn)活性,活性最高時(shí)的pH稱為該酶的最適pH。當(dāng)威蘭膠濃度為1%、反應(yīng)溫度50℃、酶底比1mL/g時(shí),采用不同pH(6、6.5、7、7.5、8)的20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液配制威蘭膠溶液,考察pH對(duì)中性蛋白酶除蛋白的影響。由圖2可知:蛋白質(zhì)降解率在pH6～8范圍內(nèi)呈現(xiàn)先升高后減小的趨勢(shì),其中在pH=7時(shí)蛋白質(zhì)去除率最高,達(dá)62.3%。

圖2 pH對(duì)中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.2 The effect of pH on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.1.3 酶底比 固定威蘭膠濃度1%、反應(yīng)溫度50℃、pH7,分別測(cè)定酶底比為0.5、1.0、1.5、2、2.5mL/g時(shí)的威蘭膠蛋白去除率,結(jié)果如圖3所示,當(dāng)酶底比增加到1.0mL/g時(shí),蛋白質(zhì)去除率增加至最高,繼續(xù)增加酶底比,威蘭膠蛋白質(zhì)去除率基本保持平穩(wěn),故選擇酶底比1.0mL/g,此時(shí)蛋白質(zhì)去除率為57.2%。

圖3 酶底比對(duì)中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.3 The effect of enzyme/substrate dosage on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.1.4 威蘭膠濃度 固定反應(yīng)溫度50℃、pH7、酶底比1mL/g,分別測(cè)定不同威蘭膠濃度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)下的蛋白質(zhì)去除率。如圖4所示,隨著威蘭膠濃度的增加,蛋白質(zhì)去除率急劇下降。這可能是威蘭膠的高粘度特性造成的結(jié)果,濃度增加使得溶液粘度急劇增加,酶的流動(dòng)性和催化行為大大受到限制?？紤]到威蘭膠產(chǎn)品發(fā)酵產(chǎn)量在10～20g/L[13-17],發(fā)酵液稀釋造成后續(xù)威蘭膠沉淀所需酒精用量增加,故選擇威蘭膠濃度1%作為最終底物濃度,此濃度下酒精使用成本較低,蛋白去除率較高。

圖4 威蘭膠濃度比對(duì)中性蛋白酶除威蘭膠蛋白的影響Fig.4 The effect of substrate concentration on deproteinization of welan gum with neutral protease

2.2 正交實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

在單因素考察的基礎(chǔ)上,固定威蘭膠濃度1%,選取溫度(A)、pH(B)、酶底比(C)為考察因素,每個(gè)因素考察3個(gè)水平,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),以蛋白去除率優(yōu)選中性蛋白酶法除威蘭膠蛋白的工藝,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由直觀分析結(jié)果可以看出3個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)去除率的影響程度不同,依次為酶底比>pH>溫度,最佳條件為A2B1C1,即溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g,反應(yīng)6h后蛋白去除率為56.3%。

在正交實(shí)驗(yàn)的最佳工藝下,即溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g時(shí),進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。測(cè)得蛋白去除率分別為62.1%、66.5%、67.2%,平均值為65.3%,3次蛋白去除率都較高,說明該正交優(yōu)化結(jié)果較好。

2.3 酶處理前后威蘭膠樣品性質(zhì)比較

2.3.1 樣品中各組分含量 如表4所示,分別測(cè)量了酶處理前后威蘭膠樣品的水分、蛋白質(zhì)、多糖含量。經(jīng)酶處理后,威蘭膠中蛋白質(zhì)含量從20.8%下降到9.7%,多糖含量由70.5%升高至80.9%。威蘭膠樣品中蛋白質(zhì)去除率達(dá)53.6%,略低于正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果,這可能與樣品制備量較多,樣品粘度較高,造成酶解反應(yīng)不夠充分,但酶解過程仍去除了高粘度威蘭膠樣品中的多半蛋白質(zhì)。

表2 中性蛋白酶酶法除威蘭膠蛋白工藝L9正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

表4 酶處理前后威蘭膠樣品中的水分、蛋白質(zhì)及多糖含量

2.3.2 表觀粘度 超高粘度是威蘭膠最突出的特性,因而酶法除蛋白應(yīng)確保酶處理后威蘭膠能保持這一優(yōu)良特性。如圖5所示,酶處理后,0.1%、1%威蘭膠表觀粘度值基本沒有改變。同時(shí),酶處理前后樣品均表現(xiàn)出“剪切變稀”的假塑性流體特性。

圖5 酶處理前后威蘭膠樣品表觀粘度比較Fig.5 Viscosity comparison of welan gum before and after enzymatic treatment

3 結(jié)論

對(duì)商品化的威蘭膠進(jìn)行了中性蛋白酶除蛋白研究。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定其最優(yōu)除蛋白工藝為:威蘭膠濃度1%、溫度50℃、pH6.5、酶底比1mL/g。最后,制備了低蛋白威蘭膠樣品,其中,蛋白質(zhì)含量從初始20.8%下降到9.7%,多糖含量由70.5%升高至80.9%,同時(shí)該樣品保持了初始威蘭膠樣品的高粘度特性。

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Study on deproteinization of welan gum with neutral protease

DENG Kuan,LI Na,SHAO Chuang,DUAN Neng,ZHANG Wang-zhong,ZHAO Meng*

(School of Food and Pharmaceutical Engineering,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

The deproteinization condition of neutral protease for welan gum and the effect of hydrolysis on welan gum properties were investigated. The conditions for neutral protease to hydrolyze protein in welan gum sample were optimized through the single factor and the orthogonal experiments. The optimal welan concentration,reaction temperature,pH and enzyme/substrate dosage of deproteinization were 1%,50℃,pH6.5 and 1mL/g,respectively. After hydrolysis for 6h under these optimal conditions,the deproteinization ratio was about 65.3%. The main component contents and apparent viscosity of welan gum samples were compared before and after the enzymatic treatment. Results showed that neutral protease reduced the protein content and increased the polysaccharide content,on the premise of maintaining the high-viscosity characteristic of welan gum. Deproteinization with neutral protease is an effective method to prepare welan gum sample with low protein and good properties.

welan gum;deproteinization;neutral protease

2014-05-04

鄧寬(1991-)，女，學(xué)士，研究方向：食品功能因子的保護(hù)和增益。

湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310500020)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)07-0093-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.010

*通訊作者:趙萌(1983-)，博士，講師，研究方向：食品功能因子的保擴(kuò)和增益。