陳洪升 周帥 陳吟霜 謝永強 張詠莉 周珍文

·實驗研究·

金黃色葡萄球菌腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因的克隆及其原核表達

陳洪升 周帥 陳吟霜 謝永強 張詠莉 周珍文

目的 在大腸桿菌中克隆、表達金黃色葡萄球菌氨基糖苷類耐藥基因：腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因, 為其功能研究奠定基礎(chǔ)。方法 按金黃色葡萄球菌腺苷酰轉(zhuǎn)移酶蛋白編碼序列設(shè)計引物, 以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板, 擴增腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因。將所得片段與pGEX-4t-1(+)載體連接, 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3), 提取質(zhì)粒進行雙酶切及測序鑒定, IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達, SDS-PAGE及Western-blot對重組蛋白進行鑒定。結(jié)果 使用金黃色葡萄球菌基因組為模板, 成功擴增約800 bp目的片段, 重組質(zhì)粒雙酶切見目的片段, 測序顯示腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因長783 bp, 啟始于ATG, 終止于TAG,預(yù)測的等電點及分子量分別為7.75、28975.44, 目的基因與Genbank金葡腺苷酰轉(zhuǎn)移酶同源性為99%, SDS-PAGE及Western-blot顯示在55 kD左右見重組蛋白表達。結(jié)論 在大腸桿菌中成功克隆、表達了金黃色葡萄球菌腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因, 為其功能研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

金黃色葡萄球菌；腺苷酰轉(zhuǎn)移酶；耐藥基因；克?。槐磉_

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus, SA)是人類化膿感染中最常見的病原菌, 可引起局部化膿感染, 也可引起肺炎及敗血癥、膿毒癥等全身感染。隨著氨基糖苷類藥物(aminoglycosides)的廣泛應(yīng)用, 金黃色葡萄球菌對氨基糖苷耐藥日益嚴(yán)重。腺苷酰轉(zhuǎn)移酶是一種跨膜多重藥物外排蛋白,介導(dǎo)了葡萄球菌對氨基糖苷類藥物(主要是親水性氨基糖苷類藥物)及多種結(jié)構(gòu)上近似甚至無關(guān)的藥物耐藥［1］。本研究對腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因進行克隆、及原核表達, 為其功能研究奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 金黃色葡萄球菌菌株(111123035)分離自廣州市婦女兒童醫(yī)療中心內(nèi)科病區(qū)11歲兒童全身多發(fā)軟組織感染的膿液。

1.1.2 主要試劑及器材 pGEX-4T-1(+)質(zhì)粒載體購自法國馬來亞公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、rTaq DNA聚合酶、EcoR Ⅰ, Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶DNA marker等購自Takara公司。IPTG、丙烯酰胺、Tris堿、預(yù)染蛋白Marker和DAB顯色劑等購自鼎國生物公司。鼠抗GST標(biāo)簽單克隆抗體購自北京康為世紀(jì)生物有限公司。上海力申公司HF safe-1200型生物安全柜, 德國Biometra公司PCR, 英國uvitec公司GAS7508-T20紫外凝膠成像分析系統(tǒng),德國Sorvall公司micro 17R臺式高速冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 最低抑菌濃度(MIC)測定 按照CLSI(2012)《抗微生物藥物敏感試驗的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》, 采用瓊脂二倍稀釋法進行。

1.2.2 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因PCR擴增 根據(jù)GenBank金黃色葡萄球菌腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因序列(CP002120.1), 設(shè)計特異性引物一對：P1：5'-CGCGAATTCATGAGCAATTTGATTAACGG-3', P2：5'-CGCCTCGAGCTAATTGAGAGAAGTTTCTA-3'。引物序列分別加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點, 進行PCR反應(yīng)。

1.2.3 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因克隆入pGEX-4T-1(+)表達載體 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因 PCR產(chǎn)物純化后, 經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ酶切純化后, 與經(jīng)相同酶切的pGEX-4T-1(+)質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)。挑取經(jīng)氨芐霉素篩選的陽性菌落提取質(zhì)粒進行PCR及雙酶切鑒定。

1.2.4 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)的誘導(dǎo)表達 將含有重組質(zhì)粒的BL21(DE3)工程菌接種于含氨芐霉素(50 μg/ml)的LB瓊脂板, 培養(yǎng)過夜后挑單菌落于含氨芐霉素LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD值0.4左右, IPTG誘導(dǎo)表達8 h, 離心20 min收集菌體, SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.5 重組蛋白Western blot分析 重組蛋白表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜, 使用HRP標(biāo)記的GST標(biāo)簽鼠單克隆抗體, DAB顯色液顯色。

2 結(jié)果

2.1 氨基糖苷類抗菌藥物的MIC 臨床分離金黃色葡萄球菌菌株(111123035)對氨基糖苷類藥物慶大霉素、阿米卡星的MIC分別為18、16 μg/ml。參照CLSI(2012)《葡萄球菌屬的MIC(μg/ml)解釋標(biāo)準(zhǔn)》, 均為耐藥。臨床檢驗該菌株對頭孢西丁MIC值為18 μg/ml, 參照CLSI(2012)《耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢測方法及判定折點》, 該菌株為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)菌株。

2.2 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的PCR擴增 以臨床分離株基因組DNA為模板, PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳, 結(jié)果顯示在800～1000 bp間見明顯特異性條帶(見圖1), 與目的基因(783 bp)大小相似。

圖1 腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的PCR擴增

2.3 重組質(zhì)粒的鑒定 從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21提取的重組質(zhì)粒, 經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后見目的條帶。測序顯示腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因長783 bp, 啟始于ATG, 終止于TAG, 預(yù)測的等電點為7.75, 分子量為28975.44, 與Genbank中編號為NC_017341.1的基因同源性為99%。氨基酸比對結(jié)果顯示僅見49位氨基酸D改變?yōu)閅。

2.4 SDS-PEGE電泳及Western-blot 0.5 mmol的IPTG誘導(dǎo)8 h后, 重組菌體經(jīng)SDS-PEGE電泳后, 在55 kD可見明顯表達帶(見圖2), 這與融合重組蛋白的理論分子量相符(26 kD GST+29 kD adenylyltransferase)。

圖2 重組腺苷酰轉(zhuǎn)移酶12% SDS-PAGE電泳圖

2.5 重組adenylyltransferase Western blot分析鑒定 使用鼠抗GST標(biāo)簽單克隆抗體進行Western-blot, 結(jié)果顯示在55 kD左右位置見目的蛋白(見圖3)。

圖3 重組蛋白表達產(chǎn)物Western-blotting

3 討論

金黃色葡萄球菌為化膿性感染的主要致病菌, 本實驗從兒童全身多發(fā)軟組織感染膿液標(biāo)本分離出一株高耐藥株(111123035), 其為MRSA, 對慶大霉素、阿米卡星的MIC分別為18、16 μg/ml, 表明其對氨基糖苷類藥物高度耐藥。

對慶大霉素等氨基糖苷抗生素耐藥是因細菌產(chǎn)生氨基糖苷類雙功能修飾酶AAC(6’)-APH(2”)鈍化酶所致［2］。該種耐藥性的決定因子在PSK-1樣質(zhì)粒上。1988 年英國 Jordens等發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對慶大霉素耐藥性并非質(zhì)粒攜帶, 而是染色體攜帶。

在大腸桿菌、酵母菌等均進行了腺苷酰轉(zhuǎn)移酶耐藥基因分離及鑒定［3］, 發(fā)現(xiàn)adenylyltransferase基因序列和蛋白分子量與報道相符［4］。

本實驗成功地對染色體介導(dǎo)的氨基糖苷耐藥基因adenylyltransferase進行了克隆和原核表達, 得到了adenyly ltransferase蛋白［5］, 為進一步進行adenylyltransferase蛋白高級結(jié)構(gòu)測定的試驗做好了準(zhǔn)備；為了解adenylyltransferase蛋白的特性和功能以及其對細菌耐藥機制的深入研究奠定了基礎(chǔ)［6］。

［1］ Borgundvaag B, Ng W, Rowe B, et al.Prevalence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in skin and soft tissue infections in patients presenting to Canadian emergency departments.CJEM, 2013, 15(3):141-160.

［2］ Woegerbauer M, Zeinzinger J, Springer B, et al.Prevalence of the aminoglycoside phosphotransferase genes aph(3')-Ⅲa and aph(3')-Ⅱa in Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subsp.enterica and Staphylococcus aureus isolates in Austria.J Med Microbiol, 2014, 63(Pt 2):210-217.

［3］ 茍冬梅, 梁麗亞, 劉嶸明, 等.過量表達煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶對大腸桿菌NZN111產(chǎn)丁二酸的影響.生物工程學(xué)報, 2012, 28(9): 1059-1069.

［4］ 郭靜霞, 魏紅山, 宋永繼, 等.高爾基體蛋白73原核表達系統(tǒng)的構(gòu)建及單克隆抗體的制備.中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 2013, 27(4): 301-303.

［5］ 黃學(xué)勇, 劉國華, 胡小寧, 等.腸道病毒71型外殼蛋白VP2基因重組表達及活性鑒定.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 48(4): 324-327.

［6］ 高珺珊, 吳威, 侯洪烈, 等.犬惡絲蟲酪蛋白激酶2β亞基基因片段的克隆和原核表達.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2013, 31(4): 290-292.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.12.196

2014-12-18］

廣州市醫(yī)藥科技重點項目(項目編號：201102A212013)；廣州市醫(yī)藥科技項目(項目編號：20131A011053)

510006 廣東藥學(xué)院(陳洪升 張詠莉)；廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(周帥 陳吟霜 謝永強 周珍文)

張詠莉 周珍文