孟 云，朱言亮

（襄陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北襄陽441021）

血漿多巴胺β羥化酶與阿爾茨海默病相關(guān)性研究

孟 云，朱言亮＊

（襄陽市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖北襄陽441021）

阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)退行性紊亂疾病，表現(xiàn)為記憶缺失和認(rèn)知功能損傷，由于人的壽命普遍延長，老齡化是AD的主要危險(xiǎn)因子之一，65歲以上的人群發(fā)病率急劇上升［1］，目前，所有關(guān)于AD病因的假說均不能解釋其全部病理特征，AD是遺傳兼環(huán)境等多因素相互作用的復(fù)雜疾病，神經(jīng)影像研究發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)和海馬及其他腦區(qū)有明顯的萎縮，早期膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能喪失［2－4］，AD患者腦干血清素能及去甲腎上腺素能神經(jīng)元胞核缺失表明這些神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)在AD發(fā)病過程中起著重要作用［3］。其中，去甲腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)與AD的病因與疾病進(jìn)程相關(guān)，但其從中所起的作用并不明確，多巴胺β羥化酶（DBH）作為一種兒茶酚胺合成酶，對去甲腎上腺素的合成與更新發(fā)揮著重要作用，在基因的調(diào)控下，血漿DBH的活性在不同個(gè)體間表現(xiàn)出廣泛的遺傳性，DBH可調(diào)節(jié)NA水平，但這一作用對AD的發(fā)生與疾病進(jìn)程的影響卻尚不清楚，在AD患者中，海馬和皮質(zhì)中DBH活性減低，可能是970T等位基因和隨后降低的DBH活性使去甲腎上腺素（NA）的合成減少并失去了神經(jīng)保護(hù)作用，因而，血漿DBH很可能是AD疾病發(fā)展和認(rèn)知功能損傷的生物標(biāo)志物，由于血漿DBH活性受基因型控制，因而本研究通過測定患者血漿DBH活性及C－970T和C1603TDBH基因多態(tài)性，以闡明DBH調(diào)節(jié)NA對AD疾病進(jìn)程的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2011年4月至2013年10月來本院接受治療的285名AD患者，患者均屬晚發(fā)散發(fā)型AD，年齡為63－95歲，平均年齡82±6.9歲，其中124名男性患者，161名女性患者；健康志愿者124名，年齡為64－96歲，平均年齡78.0±8.1歲，其中男性34人，女性90人，AD的診斷按照美國精神病學(xué)會(huì)制定的DSM－IV癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)和美國神經(jīng)病學(xué)會(huì)制定的NINCDS－ADRDA老年性癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有受試者均接受問詢以排除軸I精神障礙并評估當(dāng)前和過去的治療狀況，排除AD患者和健康對照組中診斷患有嚴(yán)重心臟病、癲癇、腦創(chuàng)傷和癌癥者；主要功能性精神障礙，如抑郁和精神分裂癥；高血壓、吸煙及酗酒?；颊叻媚憠A酯酶抑制劑或抗精神病藥，但采血前停止用藥5天，患者認(rèn)知狀況評價(jià)采用MMSE評分法，健康對照組評分為25－30平均值為28.46±2.24，AD患者評分為0－23，平均值為10.87 ±9.05，依據(jù)該評分進(jìn)一步將AD患者分為3組，其中發(fā)病早期患者75人，評分為18－24，平均值為20.54±2.13，中期108人，評分為11－18，平均值為13.68±2.16，晚期102名，評分為0－10，平均值為2.01±3.11。

1.2 指標(biāo)檢測

常規(guī)方法采血，每人采血4mL于含有1mL的抗凝劑的采血管中，血樣3 500r／min離心10分鐘，－20℃冰箱保存?zhèn)溆?，血漿DBH活性檢測采用ELISA法，其操作嚴(yán)格按照多巴胺β羥化酶活性檢測試劑盒（上海研晶生化試劑有限公司，E－ELH1226）進(jìn)行。血液樣品DNA的提取采用鹽析法，DBH（C－970T）、DBH（C 1603T）及ApoE（rs7412）多態(tài)性基因型采用ABI Prism 7000型基因測序儀進(jìn)行測定，按照美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司描述的步驟進(jìn)行操作，引物和探針購自博奧生物有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血漿DBH活性比較 見表1。

2.2 兩組患者C－970T和C1603T DBH基因多態(tài)性分布比較

AD患者與健康對照組的DBH（C－970T）基因型多態(tài)性分布未出現(xiàn)明顯漂變（χ2＝0.619，P＞0.05），符合Hardy－Weinberg平衡；AD患者與健康對照組DBH（C1603T）基因型多態(tài)性分布也未出現(xiàn)明顯漂變（χ2＝4.233，P＞0.05）。AD患者C－970T DBH和C1603TDBH多態(tài)性的基因型和T等位基因（CT＋TT）載體頻率與健康對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），見表2。

表1 健康對照組與AD組血漿DBH活性比較（±s）

表1 健康對照組與AD組血漿DBH活性比較（±s）

與男性比較＊P＞0.05，與對照組比較△P＜0.05，早期AD患者與中晚期AD患者比較＃P＜0.05

n血漿DBH活性（nmol／ml／min）124 16.45±8.12男34 17.95±9.85女90 16.23±10.22＊AD組285 8.61±5.21△男124 8.81±5.71△女161 9.23±6.02＊△發(fā)病早期75 7.09±6.11△發(fā)病中期108 13.24±7.93＃發(fā)病晚期102 2.09±7.88健康對照組＃

表2 健康對照組與AD組C－970T和C1603T DBH基因多態(tài)性分布構(gòu)成比

2.3 兩組C－970T和C1603T不同基因型患者血漿DBH活性

在AD患者組中，DBH（C－970T）基因型CC、CT、TT載體組患者血漿DBH活性分別為11.26 ±5.12nmol／min／ml、6.51±4.26nmol／min／ml和3.31±3.01nmol／min／ml，三組間兩兩比較均具有顯著性差異（P＜0.01），DBH（C－970T）基因型CC、CT、TT載體健康對照組血漿DBH活性分別為21.01±10.34nmol／min／ml、11.66±7.78nmol／min／ml和4.68±1.57nmol／min／ml，三組間兩兩比較均具有顯著性差異（P＜0.01）。在AD患者組中，DBH（1603T）基因型CC、CT、TT載體組患者血漿DBH活性分別為9.38±6.11nmol／min／mL、6.13±3.43nmol／min／mL和5.75±1.78nmol／min／mL，三組間兩兩比較無顯著性差異（P＞0.05）；在健康對照組中，DBH（1603T）基因型CC、CT載體組患者血漿DBH活性分別為15.31± 11.02nmol／min／ml、12.48±6.03nmol／min／ml和11.22±2.17nmol／min／mL，三組間兩兩比較亦無顯著性差異（P＞0.05）。見表3。

表3 健康對照組與AD組C－970T和C1603T不同基因型患者血漿DBH活性（±s）

表3 健康對照組與AD組C－970T和C1603T不同基因型患者血漿DBH活性（±s）

注：A表示與CC組比，P＜0.01；B表示與CT組比，P＜0.01

患者組健康對照組DBH（C－970T）基因型血漿DBH活性（nmol／min／ml）AD CC 11.26±5.12 21.01±10.34 CT 6.51±4.26A11.66±7.78ADBH（C1603T）基因型4.68±1.57AB15.31±11.02 12.48±6.03 11.22±2.17 TT CC CT TT 3.31±3.01AB9.38±6.11 6.13±3.43 5.75±1.78

2.4 DBH C－970T和C1603T多態(tài)性對AD患者DBH活性的影響

為了進(jìn)一步明確基因?qū)ρ獫{DBH活性的影響，對DBH C－970T和C1603T多態(tài)性對DBH活性的作用進(jìn)行了評價(jià)，雙因素方差分析DBH C－970T多態(tài)性與分期診斷對血漿DBH活性影響表明，分期診斷（F＝24.734，P＜0.01）和基因型（F＝47.765，P＜0.01）均對血漿DBH活性有明顯影響，但分期診斷與基因型間無明顯相互作用（F＝0.281，P＞0.05），早、中、晚期AD患者CC、CT和TT基因型頻率亦無顯著性差異；通過調(diào)整年齡、性別及ApoE4等位基因等因素進(jìn)行回歸分析表明，AD與DBH C－970T基因型CC和T等位基因之間無明顯相關(guān)性（OR＝1.12，95%CI 0.86－4.35，P＞0.05）；雙因素方差分析DBH C1603T多態(tài)性與分期診斷對血漿DBH活性影響表明，DBH C1603T基因型（F＝4.304，P＜0.05）和分期診斷（F＝13.240，P＜0.01）均對血漿DBH活性具有明顯影響，但二者之間無明顯相互作用（F＝0.004，P＞0.05），通過調(diào)整年齡、性別及ApoE4等位基因等因素進(jìn)行回歸分析表明，AD與DBH C1603T基因型CC和T等位基因之間無明顯相關(guān)性（OR＝0.91，95%CI 0.35－2.23，P＞0.05）。

3 討論

去甲腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)有兩個(gè)主要部分，一個(gè)源于腹側(cè)被蓋區(qū)的去甲腎上腺素能細(xì)胞體，主要參與性行為和飲食行為，另一個(gè)源于藍(lán)斑，與學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能相關(guān)［5，6］，藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元缺失與胞外β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積增加［6］、AD早期神經(jīng)纖維異常、發(fā)病及持續(xù)性癡呆［7］有關(guān)，在AD患者的多個(gè)腦區(qū)NA濃度明顯降低［8］，另外，AD腦脊液NA水平升高支持了膽堿能神經(jīng)和去甲腎上腺素能神經(jīng)元缺失產(chǎn)生代償?shù)募僬f［8，9］，一些研究認(rèn)為NA不僅是AD的危險(xiǎn)因子，而且是真正的病原因子［7，10，11，12］，除作為神經(jīng)遞質(zhì)，NA還是內(nèi)源性抗炎物質(zhì)，通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞來抑制炎癥［13］，因此，說明藍(lán)斑神經(jīng)細(xì)胞死亡與NA介導(dǎo)的抗炎蛋白缺失可使炎癥加劇，從而導(dǎo)致AD的發(fā)生。

多巴胺β羥化酶（DBH）可催化多巴胺對NA的氧化羥化，DBH存在于去甲腎上腺素能神經(jīng)元、外周神經(jīng)節(jié)后交感神經(jīng)元及腎上腺髓質(zhì)，是突觸囊泡內(nèi)唯一的兒茶酚胺合成酶，以游離和膜結(jié)合狀態(tài)存在，DBH與NA可通過胞吐作用共同釋放，可在腦脊液、血漿及血清中檢測到，血漿DBH活性受遺傳因素調(diào)控，其個(gè)體差異大，血漿DBH活性非常穩(wěn)定，不會(huì)因機(jī)體活動(dòng)等發(fā)生變化，單核苷酸多態(tài)性分析DBH基因啟動(dòng)子C－970T區(qū)可解釋30%－50%的DBH活性差異，而且等位基因T－970可通過共顯性遺傳降低血漿DBH的活性［14］，后者似乎能夠解釋血漿DBH活性差異，但內(nèi)含子11中C1603T多態(tài)性的作用幾乎沒有［15，16］。

本研究結(jié)果表明，與相同年齡條件下的健康對照組相比，AD患者血漿DBH活性的降低并不依賴于基因型，從血漿DBH活性與AD的嚴(yán)重程度的關(guān)系來看，AD發(fā)病初患者藍(lán)斑去甲腎上腺素能神經(jīng)元能夠增加NA產(chǎn)生的活性，顯然是去甲腎上腺素能神經(jīng)元缺失的一種代償作用，這一研究結(jié)果表明AD患者早期應(yīng)用選擇性去甲腎上腺素重?cái)z取抑制劑治療使藍(lán)斑缺失的去甲腎上腺素能神經(jīng)元得到補(bǔ)償，后期將繼續(xù)研究DBH活性變化對去甲腎上腺素能神經(jīng)元缺失的代償機(jī)制。

［1］Alzheimer＇s Association.2010Alzheimer＇s disease facts and figures［J］.Alzheimers Dement，2010，6：158.

［2］Giacobini E.Cholinergic function and Alzheimer＇s disease［J］.Int J Geriatr Psychiatry，2003，18：S1.

［3］Lyness SA，Zarow C，Chui HC.Neuron loss in key cholinergic and aminergic nuclei in Alzheimer disease：a meta－analysis［J］.Neurobiol Aging，2003，24：1.

［4］Wenk GL.Neuropathologic changes in Alzheimer＇s disease［J］.J Clin Psychiatry，2003，64：7.

［5］Grudzien A，Shaw P，Weintraub S，et al.Locus coeruleus neurofibrillary degeneration in aging，mild cognitive impairment and early Alzheimer＇s disease［J］.Neurobiol Aging，2007，28：327.

［6］Heneka MT，Nadrigny F，Regen T，et al.Locus ceruleus controls Alzheimer＇s disease pathology by modulating microglial functions through norepinephrine［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107：6058.

［7］Counts SE，Mufson EJ.Noradrenaline activation of neurotrophic pathways protects against neuronal amyloid toxicity［J］.J Neurochem，2010，113：649.

［8］Herrmann N，Lanctot KL，Khan LR.The role of norepinephrine in the behavioral and psychological symptoms of dementia［J］.J Neuropsychiatry Clin Neurosci，2004，16：261.

［9］Giubilei F，Calderaro C，Antonini G，et al.Increased lymphocyte dopamine beta－h(huán)ydroxylase immunoreactivity in Alzheimer＇s disease：compensatory response to cholinergic deficit［J］.Dement Geriatr Cogn Disord，2004，18：338.

［10］Fitzgerald PJ.Is elevated norepinephrine an etiological factor in some cases of Alzheimer＇s disease？［J］.Curr Alzheimer Res，2010，7：506.

［11］Weinshenker D.Functional consequences of locus coeruleus degeneration in Alzheimer＇s disease［J］.Curr Alzheimer Res，2008，5：342.

［12］McMillan PJ，White SS，F(xiàn)ranklin A，et al.Differential response of the central noradrenergic nervous system to the loss of locus coeruleus neurons in Parkinson＇s disease and Alzheimer＇s disease［J］.Brain Res，2011，1373：240.

［13］Szot P，White SS，Greenup JL，et al.Compensatory changes in the noradrenergic nervous system in the locus ceruleus and hippocampus of postmortem subjects with Alzheimer＇s disease and dementia with Lewy bodies［J］.J Neurosci，2006，26：467.

［14］Heneka MT，O＇Banion MK.Inflammatory processes in Alzheimer＇s disease［J］.J Neuroimmunol，2007，184：69.

［15］Zabetian CP，Buxbaum SG，Elston RC，et al.The structure of linkage disequilibrium at the DBH locus strongly influences the magnitude of association between diallelic markers and plasma dopamine beta－h(huán)ydroxylase activity［J］.Am J Hum Genet，2003，72：1389.

［16］Tang Y，Anderson GM，Zabetian CP，et al.Haplotype－controlled analysis of the association of a non－synonymous single nucleotide polymorphism at DBH（＋1603C→T）with plasma dopamine beta－h(huán)ydroxylase activity［J］.Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet，2005，139B：88.

2014－10－22）

1007－4287（2015）09－1505－03

＊通訊作者