李 杰，楊 帆，封建凱，孫成銘，黃萬里，張 霞＊

（1.青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗科，山東煙臺264000；2.棲霞市人民醫(yī)院檢驗科；3.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院檢驗科）

節(jié)律基因per2在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)及與bcr／abl的相關(guān)性

李 杰1，楊 帆2，封建凱3，孫成銘1，黃萬里1，張 霞1＊

（1.青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院檢驗科，山東煙臺264000；2.棲霞市人民醫(yī)院檢驗科；3.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院檢驗科）

目的 探討節(jié)律基因per2在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)及其與白血病融合基因bcr／abl的關(guān)系。方法收集30例慢性粒細(xì)胞白血病病人和9例健康對照的骨髓標(biāo)本，RT－PCR檢測per2和bcr／abl融合基因的表達(dá)，并分析兩者之間表達(dá)的關(guān)系；不同濃度甲磺酸伊馬替尼作用K562細(xì)胞不同時間后，通過RT－PCR檢測bcr／abl和per2水平變化。結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)per2在慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)降低，并且與bcr／abl的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。用甲磺酸伊馬替尼處理K562發(fā)現(xiàn)，隨著bcr／abl的表達(dá)降低，per2的表達(dá)升高。結(jié)論 per2在慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)下降，并且和bcr／abl的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示per2在慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

慢性粒細(xì)胞白血??；K562細(xì)胞；per2；bcr／abl

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1481）

慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）是一種造血干細(xì)胞惡性克隆增殖性疾病，其遺傳學(xué)特征為t（9，22）（q34；q11），產(chǎn)生bcr／ab1融合基因，導(dǎo)致自身及細(xì)胞內(nèi)多種底物蛋白酪氨酸殘基磷酸化，激活多條信號傳導(dǎo)途徑，干擾細(xì)胞的基本活動，導(dǎo)致CML產(chǎn)生。因此，bcr／abl酪氨酸激酶目前被認(rèn)為是治療CML最理想的分子靶點。最新研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘系統(tǒng)不僅在晝夜生物節(jié)律方面起重要作用，而且參與機(jī)體其他功能的調(diào)節(jié)。該系統(tǒng)一旦失調(diào)可能引起一系列嚴(yán)重疾病發(fā)生，如淋巴瘤、白血病、乳腺癌和抑郁癥等［1］。目前有研究表明per2在腫瘤中表達(dá)異常，但是在CML中的表達(dá)研究尚少，本研究檢測per2在CML中的表達(dá)，以及其與bcr／ab1的關(guān)系，探討生物鐘基因per2在CML發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 病例資料 所有病例均來自煙臺毓璜頂醫(yī)院2009年到2012年的CML患者，經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和染色體檢查符合CML診斷標(biāo)準(zhǔn)。9例造血干細(xì)胞移植的健康供者作為正常對照。

1.2 試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，PCR試劑盒購自TIANGEN公司，DL2000購自TAKARA公司，Trizol購自Invitrogen公司。引物使用Primer Primier 5.0軟件設(shè)計，由上海博亞公司合成。其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物干預(yù) 慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562為本實驗室保存。在含10%小牛血清、100μg／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中以37℃，5%的CO2培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，分別加入0.5，1，5μmol／L的甲磺酸伊馬替尼，分別于24，48h之后收獲細(xì)胞用來做RT－PCR檢測。

1.3.2 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄 將收集的臨床標(biāo)本和收獲的細(xì)胞中加入Trizol試劑1ml，參照Trizol試劑說明書的操作抽提RNA，用分光光度計測定濃度之后，取3μg RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，用來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.3 RT－PCR檢測 以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Per2上游引物：5’ATTCTCCCATTCGGTTTC 3’，下游引物5’GAGGTCTGGCTCATAAGGT 3’；PCR擴(kuò)增條件為95℃5min，95℃30s，52℃30s，72℃30s，72℃5 min，30個循環(huán)。bcr／ab1上游引物5’ATCCGTG－GAGCTGCAGATG3’，下游引物5’TTCCAACGAGCGGCTTCACT3’；β－actin上游引物5 GGCATCGTGATGGACTCCG3’，下游引物5’GCTGGAAGGTGGACAGCGA3’。擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，UVP掃描并分析結(jié)果。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Prism 4.03統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較行t檢驗，采用相關(guān)性分析的方法分析bcr／abl和per2表達(dá)的關(guān)系，P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 per2在慢性粒細(xì)胞白血病病人中表達(dá)明顯降低 RT－PCR結(jié)果顯示，與健康對照組相比，慢性粒細(xì)胞白血病病人表達(dá)per2明顯降低。進(jìn)一步分析9例健康對照和30例慢性粒細(xì)胞白血病人中的per2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05（見圖1）。

圖1 RT－PCR檢測per2和bcr－abl的表達(dá)

2.2 per2和bcr／abl在CML中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)對同時進(jìn)行per2和bcr／abl檢測的30例慢性粒細(xì)胞白血病人的標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，per2和bcr／abl在慢粒病人中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，r＝－0.3778，P＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖2）。

在K562細(xì)胞中，用伊馬替尼抑制bcr／abl的表達(dá)后，per2表達(dá)升高為了進(jìn)一步確定per2和bcr／abl在慢性粒細(xì)胞白血病中的關(guān)系，我們用伊馬替尼處理CML細(xì)胞系K562，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理24和48小時之后，bcr－abl的表達(dá)下降，而且per2的表達(dá)上升，如圖3所示，1μM和5μM的伊馬替尼處理24小時和48小時之后，per2的表達(dá)均有明顯上調(diào)，差距有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 per2和bcr－abl表達(dá)的相關(guān)性分析

圖3 伊馬替尼處理K562細(xì)胞后per2和bcr－abl的表達(dá)

3 討論

節(jié)律系統(tǒng)普遍存在于生物界，當(dāng)其系統(tǒng)異?；蚱浠蛲蛔儠r，機(jī)體正常機(jī)能將被打亂，甚至產(chǎn)生一些疾病，如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤等。機(jī)體通過近日節(jié)律調(diào)控原癌基因、抑癌基因及凋亡基因的表達(dá)，對腫瘤發(fā)生具有直接或間接的作用，一旦生物鐘基因表達(dá)異常引發(fā)節(jié)律改變即可促使腫瘤生長或患癌風(fēng)險增加。目前，已經(jīng)識別的哺乳動物的晝夜節(jié)律由一個自動調(diào)整的轉(zhuǎn)錄－翻譯反饋回路組成，包括4種基因／蛋白質(zhì)：BMal1，Clock，Cryptochrome和Period。其中per基因分為per1，per2，per3，研究顯示Per基因在多種類型的白血病和淋巴瘤中表達(dá)下調(diào)，per2敲基因小鼠與野生小鼠相比發(fā)生淋巴瘤的幾率增加10倍［2］。研究大量白血病和淋巴瘤病人以及正常對照骨髓和扁桃體中per2的表達(dá)顯示，per2的表達(dá)在AML和DLBCL中表達(dá)明顯下調(diào)［3］。

在本研究中，我們選用了全新的病例，結(jié)果與本課題組前期研究一致［4］，發(fā)現(xiàn)per2在CML病人骨髓中的表達(dá)降低，并且和bcr／abl的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，為了進(jìn)一步驗證該結(jié)論，在細(xì)胞系K562中通過甲磺酸伊馬替尼處理細(xì)胞后，隨著bcr／abl的表達(dá)降低，per2的表達(dá)升高。曾有學(xué)者研究per基因在CML病人的外周血比正常人的表達(dá)降低，和我們的研究結(jié)論是一致的，并且在CML病人中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)per2和per3啟動子的CpG發(fā)生甲基化，在原始細(xì)胞危象的病人中per3甲基化的頻率比在慢性期的病人中明顯要高［5］，提示我們per2基因的表達(dá)降低可能由于其存在高頻率的甲基化。另有體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明在人類和小鼠AML和前B淋巴細(xì)胞中強(qiáng)迫表達(dá)per2可以引起細(xì)胞生長抑制，細(xì)胞周期阻滯，凋亡和喪失克隆能力［6，7］。在人白血病細(xì)胞的體外研究中發(fā)現(xiàn)C／EBPα誘導(dǎo)per2表達(dá)至少在一定程度上參與了C／EBPα的腫瘤抑制功能［8，9］。

bcr－abl基因的產(chǎn)生是慢性粒細(xì)胞白血病的重要發(fā)生機(jī)制，基于此機(jī)制的靶向治療藥物酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)用使CML治療大為改觀，但其耐藥的產(chǎn)生使其遠(yuǎn)期療效仍不容樂觀，通過本研究為尋求新的治療方法提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

［1］Tomaszewski M，Samani NJ.Genes，circadian clock and nocturnal blood pressure［J］.J Hypertens，2009，27（12）：2344.

［2］Fu L，Pelicano H，Liu J，et al.The circadian gene Period2plays an important role in tumor suppression and DNA damage response in vivo［J］.Cell，2002，111：41.

［3］Gery S，Gombart AF，Yi WS，et al.Transcription profiling of C／EBP targets identifies Per2as a gene implicated in myeloid leukemia［J］.Blood，2005，106：2827.

［4］孫成銘，馮文莉，寇新明，等.節(jié)律基因在慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)水平及意義［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（03）：315.

［5］Yang MY，Chang JG，Lin PM，et al.Downregulation of circadian clock genes in chronic myeloid leukemia：alternative methylation pattern of hPER3［J］.Cancer Sci，2006，97：1298.

［6］Hoffman AE，Zheng T，Stevens RG，et al.Clock－cancer connection in non－Hodgkin’s lymphoma：agenetic association study and pathway analysis of the circadian gene cryptochrome 2［J］.Cancer Res，2009，69：3605.

［7］Zhu Y，Leaderer D，Guss C，et al.Ala394Thr polymorphism in the clock gene NPAS2：a circadian modifier for the risk of non－Hodgkin’s lymphoma［J］.Int J Cancer，2007，120：432.

［8］Koschmieder S，Halmos B，Levantini E，et al.Dysregulation of the C／EBPalpha differentiation pathway in human cancer［J］.J Clin Oncol，2009，27：619.

［9］Bozek K，Relógio A，Kielbasa SM，et al.Regulation of clock－controlled genes in mammals［J］.PLoS One，2009，4：4882.

Expression of per2 gene in CML and its relationship with bcr／abl

LI Jie，YANG Fan，F(xiàn)ENG Jian－kai，et al.（The Clinical Laboratorg Yantai Yu－h(huán)uangding Affiliated Hospital of Qingdao Unlversity，Yantai 264000，China）

Objective This study was aimed to detect the expression of per2and bcr／abl in chronic myeloid leukemia（CML），and to analyze their relationship and potential significance.Methods 30cases of CML patients and 9cases of healthy people control were collected，their expression of per2and bcr／abl were detected by RT－PCR，their relationship was analyzed by correlation analysis.After K562cells were treated with different concentrations of Gleevie，the expression of per2and bcr／abl were detected by RT－PCR.Results We found that per2expression was downregulated in CML patients compared with control，and negative correlated with expression of bcr／abl.Moreover，expression of per2was enhanced in K562cells after treated with Gleevie，accompanied with decreased expression of bcr／abl.Conclusion per2 expression was decreased in CML patients compared with healthy control and negative correlated with bcr／abl expression，which suggested that per2may play an important role in the occurrence and development of CML.

chronic myeloid leukemia；K562cell；per2；bcr／abl

R733.7

A

2014－04－11）

1007－4287（2015）09－1481－03

煙臺市科技發(fā)展計劃（2012071）

＊通訊作者，E－mail：zx717＠163.com