郭鳳軍，鄒穎剛，范麗梅，田靜巖，崔滿華＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春130041；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部泌尿外科，吉林長春130031）

微小RNA－92在上皮性卵巢癌患者血清中的篩查

郭鳳軍1，鄒穎剛1，范麗梅1，田靜巖2＊，崔滿華1＊

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林長春130041；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院二部泌尿外科，吉林長春130031）

目的 檢測微小RNA－92（microRNA－92，miR－92）在上皮性卵巢癌患者及健康人血清中的表達(dá)，分析miR－92與上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）病人的分期及預(yù)后的關(guān)系，為尋找一種新型的、無創(chuàng)的用于EOC患者早期篩查及判斷預(yù)后的標(biāo)志物提供理論依據(jù)。方法 采用實(shí)時定量PCR（qRT－PCR）的方法檢測50例EOC患者和50例健康人群血清中miR－92表達(dá)，應(yīng)用ROC曲線評價其臨床診斷價值，并對miR－92的表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，評價其判斷預(yù)后的臨床價值。結(jié)果 miR－92作為EOC篩查的標(biāo)志物具有可行性，受試者工作特征曲線下面積達(dá)0.803；miR－92在EOC患者血清中的表達(dá)量顯著高于正常對照組（P＜0.05）；其表達(dá)水平隨EOC患者臨床分期的進(jìn)展呈上升趨勢，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。其表達(dá)水平與EOC患者年齡等因素?zé)o關(guān)。結(jié)論 miR－92在EOC患者血清中的表達(dá)高于健康人群，提示其可能在EOC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮致癌基因的作用，miR－92有望成為EOC早期篩查和評估預(yù)后的特異性生物標(biāo)志物。

miR－92；生物標(biāo)志物；血清；上皮性卵巢癌

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1478）

卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居第6位，而死亡率卻位居第1位［1］。早期診斷，患者生存率可達(dá)90%以上，但由于本病早期缺乏明顯的臨床表現(xiàn)，超過三分之二的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時己有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率在30%左右［2］。尋找一種無創(chuàng)的、有效的早期診斷卵巢癌的手段對于提高卵巢癌患者的生存率至關(guān)重要。近年來人們發(fā)現(xiàn)某些微小RNAs（microRNAs，miRNAs）在某些人類腫瘤患者的血液中異常表達(dá)，且血液中的miRNA容易獲得，不易被內(nèi)源性的RNA酶降解［3］，所以檢測循環(huán)血中的miRNA是一種很有前景的腫瘤診斷及預(yù)后評價方法。然而關(guān)于EOC患者循環(huán)血中miRNAs的報道很少。本研究檢測了miR－92在EOC患者及健康人血清中的表達(dá)，旨在為EOC的早期診斷及預(yù)后評估提供新的生物標(biāo)志。

1 對象與方法

1.1 對象及主要試劑

選擇2010年3月至2012年5月因EOC在我院行手術(shù)治療的患者50例，健康對照人群50例?；颊吣挲g22－74歲，平均49.2歲。按FIGO的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期8例，Ⅳ期7例；有淋巴轉(zhuǎn)移者24例。病人組術(shù)前均未接受過放療、化療或激素治療，術(shù)后均經(jīng)病理確診。對照組患者年齡23－72歲，平均48.9歲。所有樣本均經(jīng)研究對象同意，并簽署知情同意書。實(shí)驗(yàn)組術(shù)前和對照組均于清晨空腹抽靜脈血5ml，離心分離血清后保存于－80℃冰箱中。

血漿miRNAs抽提試劑盒購自美國Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司，SYBR qRT－PCR試劑盒購自TaKaRa－寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取血清總RNA 取0.5ml血清，加入1 ml Trizol試劑，按Trizol試劑盒說明提取總RNA。應(yīng)用美國Thermo公司的NanoDropND－1000紫外分光光度儀檢測RNA溶液的D260／D280比值，計(jì)算RNA的濃度和純度，D260／D280比值在1.8－2.1者用于下一步實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取2μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為：16℃5min，42℃30min，85℃10min。miR－92PCR擴(kuò)增的上游引物序列為5′－GCGGTAGCTTATCAGACTGA－3′，下游引物序列為5′－TGCGTGTCGTGGAGTC－3′。內(nèi)參miR－16PCR擴(kuò)增的上游引物序列為5′－CACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA－3′，下游引物序列為5′－TGGTGTCGTGGAGTCG－3′。

1.2.3 實(shí)時熒光定量反應(yīng) PCR反應(yīng)條件為：95℃10s，95℃12s，62℃20s。40個循環(huán)。

每次循環(huán)結(jié)束執(zhí)行溶解曲線進(jìn)行分析，記錄CT值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2－△△CT表示miR－92的相對表達(dá)量，miR－16作為內(nèi)參，美國ABI Prism 7300SDS軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－92在EOC患者血清與對照組血清中的表達(dá)

結(jié)果表明，miR－92在EOC患者血清中的相對表達(dá)量顯著高于健康對照組（P＜0.05）。受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC曲線）分析結(jié)果表明，miR－92診斷EOC的敏感性和特異性分別為79.7%和84.5%。ROC曲線下面積（the areas under the ROC curve AUC）為0.803，95%的可信區(qū)間為0.735－0.871。

圖1 miR－92做為篩查EOC的診斷方法的ROC工作曲線

2.2 EOC患者血清中miR－92表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系

由表1可見，隨著EOC臨床分期的進(jìn)展，miR－92表達(dá)有上升的趨勢，Ⅲ期和Ⅳ期EOC患者中miR－92的相對表達(dá)量顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期。血清miR－92表達(dá)與患者淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。血清miR－92表達(dá)與EOC患者年齡間無明顯相關(guān)性。

表1 血清miR－92的表達(dá)與EOC患者臨床病理特征間的關(guān)系

3 討論

MiRNAs是一類長度為18－24nt的非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA序列，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。最近研究表明，miRNAs通過調(diào)控腫瘤相關(guān)基因表達(dá)及介導(dǎo)上皮細(xì)胞－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種途徑參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［4－6］。文獻(xiàn)報道［7］，某些循環(huán)血液中的miRNAs同組織中的miRNAs一樣具有腫瘤相關(guān)性和組織特異性。且循環(huán)中的miRNAs可以抵抗RNase的破壞，比較穩(wěn)定，臨床容易獲得，便于推廣應(yīng)用，所以血液中的miRNAs可用于腫瘤相關(guān)研究的檢測。

近年，關(guān)于血清中的miR－92與腫瘤之間關(guān)系的研究報道還不多。其在某些腫瘤患者血清中表達(dá)下調(diào)，在某些腫瘤患者血清中表達(dá)上調(diào)。Tanaka M［8］和Romilda C［9］等報道，肝癌和急性白血病患者血漿中的miR－92水平較對照組顯著降低，miR－92與miR－618的比值可以有效區(qū)分白血病患者和正常人，推測血漿miR－92與miR－618的比值很可能成為一個非常有潛力的篩查白血病的生物指標(biāo)。Adam L等人［10］的研究報道，血漿中miR－92的表達(dá)水平與膀胱癌患者的臨床分期呈負(fù)相關(guān)，推測血漿中miR－92的水平可以作為判斷膀胱癌患者預(yù)后的生物指標(biāo)。學(xué)者們相繼對血漿miR－92在結(jié)直腸癌患者早期篩查中的價值進(jìn)行探討，一致認(rèn)為結(jié)腸癌患者血漿中的miR－92表達(dá)較正常人升高，miR－92可以作為一個無創(chuàng)性的早期診斷結(jié)直腸癌的標(biāo)志物［11－14］。Resnick KE等［15］采用基因芯片的方法對28個卵巢癌患者，15個健康對照的血清進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者血液中miR－21、miR－92、miR－93、miR－126呈高水平，miR－155、miR－127呈低水平。有3例卵巢癌病人CA125表達(dá)正常，而miR－21、miR－92、miR－93水平卻升高。

本研究進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，采用qRT－PCR的方法，探討了是否可以將miR－92作為診斷EOC的標(biāo)志物。結(jié)果表明，miR－92作為EOC篩查的標(biāo)志物，具有良好的敏感性和特異性，血清中的miR－92能有效區(qū)分EOC患者和健康人群。miR－92的高表達(dá)與EOC患者的高分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等主要的預(yù)后相關(guān)因素密切相關(guān)。推測miR－92參與了EOC的發(fā)展與轉(zhuǎn)移過程，對EOC具有重要的診斷和預(yù)測預(yù)后的價值。

本研究的樣本數(shù)還不是很多，未來的研究應(yīng)該擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)一步探討miR－92與CA125等其它標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用對卵巢癌診斷及預(yù)后預(yù)測的價值，以及miR－92與卵巢癌患者對化療藥的反應(yīng)間是否存在聯(lián)系，探討miR－92在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)理和靶基因，以及可以針對miR－92對卵巢癌患者進(jìn)行基因治療。這對于未來卵巢癌患者的診治將是非常有意義的研究方向。

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Detection of Serum MicroRNA－92 in Patients with Epithelial Ovarian Carcinoma

GUO Feng－jun，ZOU Ying－gang，F(xiàn)AN Li－mei，et al.（Department of Obstetrics and Gynaecology，The Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China）

Objective The present study prospectively detected the status of miRNA－92（miR－92）in the serum of EOC patients and healthy controls，and investigated the relationship between miR－92and the clinical staging and grading of EOC patients.Aim to provide theoretical basis for a new noninvasive screening and assessing prognosis method for EOC patients.Methods The relatively expression levels of miR－92in serum samples from 50EOC patients and 50 healthy controls were measured by using quantitative reverse transcription－polymerase chain reaction（qRT－PCR）.ROC curve was applied to evaluate the clinical diagnosis value.In addition，the associations between serum miR－92concentrations and clinical characters were analysed to assesse the clinical prognosis value.Results As a maker of EOC，serum miR－92is feasible with 0.803the areas under the receiver operator characteristic curve.The serum concentration of miR－92in EOC patients was significantly higher than that in healthy controls（P＜0.05）.The expression of miR－92 was correlated to progression of the clinical stages and regional lymph nodes（P＜0.05），There was no significant association between expression of miR－92and age.Conclusion These findings imply that expression of miR－92in EOC patients was significantly higher than healthy controls and miR－92may promote the initiation and progression of EOC.The detection of miR－92in serum might become a novel non－invasive tumor biomarker in early detection and assessment of prognosis of EOC.

MiR－92，Biomarker，Serum，Epithelial ovarian carcinoma

R737.31

A

2014－03－06）

1007－4287（2015）09－1478－03

吉林大學(xué)白求恩青年科研基金項(xiàng)目（2013206037）

＊通訊作者