趙 鑫，常 穎，劉玉俠，盧衛(wèi)平，王 哲，王 寶，于 鴻，王啟文＊

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長(zhǎng)春130012）

培養(yǎng)不同時(shí)間CIK細(xì)胞免疫表型變化與其抗腫瘤活性關(guān)系的研究

趙 鑫1，常 穎1，劉玉俠2，盧衛(wèi)平1，王 哲1，王 寶1，于 鴻2，王啟文1＊

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長(zhǎng)春130012）

目的 探討培養(yǎng)不同時(shí)間的CIK（cytokine induced killer cells）細(xì)胞免疫表型變化及其對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的關(guān)系，為CIK臨床治療腫瘤提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法 分離人外周血單核細(xì)胞，加IFNγ、IL1α、CD3Ab、IL－2等細(xì)胞因子誘導(dǎo)CIK細(xì)胞并進(jìn)行鑒定，將經(jīng)過鑒定的CIK與肺癌細(xì)胞A549共同培養(yǎng)，檢測(cè)不同時(shí)間培養(yǎng)的CIK表型變化與對(duì)A549的體外殺傷效果的關(guān)系。結(jié)果 培養(yǎng)不同時(shí)間（10天、15天、20天）的CIK細(xì)胞CD3＋CD56＋CD16＋表達(dá)率分別為42.1%，63.3%，77.1%，對(duì)A549的殺傷效率分別為41.75%，54.43%，79.31%。結(jié)論 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，CIK免疫表型表達(dá)率逐漸上升，對(duì)A549的殺傷效率也隨之逐漸增強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)殺傷活性最高為20天，提示在臨床應(yīng)用時(shí)可以根據(jù)不同時(shí)間CIK免疫表型表達(dá)情況選擇應(yīng)用時(shí)間，達(dá)到使用的最佳效果。

CIK細(xì)胞；細(xì)胞表型；肺癌細(xì)胞A549；殺傷活性

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1455）

惡性腫瘤的治療除了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療等方法，生物治療也是腫瘤治療的一種選擇。由于生物治療對(duì)病人沒有明顯的副作用，所以對(duì)不能手術(shù)的病人以及放療、化療后的病人的后續(xù)治療起到非常重要的作用。CIK（cytokine induced killer cells）作為生物治療方法的一種，由于它對(duì)腫瘤強(qiáng)大的殺傷力以及無MHC限制等特點(diǎn)，使它的應(yīng)用備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)選擇肺癌細(xì)胞A549作為CIK殺傷作用的靶細(xì)胞，比較培養(yǎng)不同時(shí)間的CIK表型變化與對(duì)肺癌細(xì)胞A549殺傷活性的關(guān)系，為CIK的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液IMDM，購(gòu)于Gibco公司；細(xì)胞因子IFN－γ，上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司；IL－1α，Peprotech公司；anti－h(huán)unman CD3，R＆D公司；IL－2，北京四環(huán)生物制藥有限公司；FCS，北京元亨；CCK8，購(gòu)自上海同仁化學(xué)研究所；anti－h(huán)unman CD3－FITC，anti－h(huán)unman CD16、CD56－PE，購(gòu)自BD公司。

1.2 人肺癌細(xì)胞A549 吉林省腫瘤防治研究所保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 低溫高速離心機(jī)，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，芬蘭雷勃公司；流式細(xì)胞儀，BD公司。

1.4 CIK細(xì)胞的培養(yǎng) 用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單核細(xì)胞，加IFN－γ，IL－1α，anti－h(huán)unman CD3，IL－2等細(xì)胞因子，每3天換液，補(bǔ)加細(xì)胞因子。

1.5 CIK的鑒定 在培養(yǎng)的第10天，15天，20天分別用anti－h(huán)unman CD3－FITC，anti－h(huán)unman CD16、CD56－PE標(biāo)記CIK細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測(cè)定表達(dá)率。

圖1 CIK表型鑒定結(jié)果

1.6 CIK殺傷活性測(cè)定

1.6.1 培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549 將A549細(xì)胞從液氮中取出，復(fù)蘇，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5× 104／ml，加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100μl／孔，6復(fù)孔。

1.6.2 將培養(yǎng)的CIK細(xì)胞分別在第10、15、20天計(jì)數(shù)，調(diào)細(xì)胞數(shù)為1.25×106／ml，加到已接種A549的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（效靶比為25∶1），100μl／孔，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞（CIK）對(duì)照組和靶細(xì)胞（A549）對(duì)照組，每組設(shè)6復(fù)孔，培養(yǎng)24h。

1.6.3 培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入CCK8，20μl／孔，培養(yǎng)結(jié)束后，用酶標(biāo)儀在492nm處測(cè)OD值。

1.6.4 殺傷活性測(cè)定方法 殺傷活性（%）＝［（1－實(shí)驗(yàn)組OD值－效應(yīng)細(xì)胞OD值）／靶細(xì)胞OD值］×100%。

1.7 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 采用成對(duì)雙樣本均值T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 CIK表型鑒定結(jié)果 培養(yǎng)10天CIK細(xì)胞CD3＋CD56＋CD16＋表達(dá)率為42.1%，見圖1a。培養(yǎng)15天CIK細(xì)胞CD3＋CD56＋CD16＋表達(dá)率為63.3%，見圖1b。培養(yǎng)20天CIK細(xì)胞CD3＋CD56＋CD16＋表達(dá)率為77.1%，見圖1c。

2.2 培養(yǎng)不同時(shí)間CIK對(duì)A549的殺傷活性，見表1。

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間CIK對(duì)A549的殺傷活性（±s，n＝6）

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間CIK對(duì)A549的殺傷活性（±s，n＝6）

※P＜0.01，與10天比較，△△P＜0.01，與10天，15天比較。

分組時(shí)間 靶細(xì)胞組（A549）效應(yīng)細(xì)胞組（CIK）實(shí)驗(yàn)組（CIK＋A549）殺傷活性（%）10天2.284±0.074 1.124±0.059 2.454±0.075 41.75±3.31 15天2.546±0.141 1.499±0.048 2.659±0.048 54.43±1.89※20天2.233±0.068 1.359±0.265 1.821±0.156 79.31±7.01△△

3 討論

CIK細(xì)胞作為腫瘤生物治療的一種，由于其強(qiáng)大的抗瘤活性和非限制性的殺瘤特點(diǎn)，近年來在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)不同時(shí)間的CIK細(xì)胞表型變化及對(duì)肺腺癌的殺傷活性的研究，為CIK治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

肺癌是近年來發(fā)病率比較高的惡性腫瘤，針對(duì)肺癌的治療方法主要是手術(shù)、化療、放療等，在這些治療中或治療后，病人往往出現(xiàn)免疫功能低下等問題，影響治療的進(jìn)行及治療效果，需要其它方法配合治療。生物治療因?yàn)榭梢灾苯庸裟[瘤細(xì)胞，調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫功能，無放療、化療的副作用，在腫瘤的綜合治療中起著非常重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)選用培養(yǎng)不同時(shí)間的CIK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞A549進(jìn)行體外殺傷活性實(shí)驗(yàn)，首先對(duì)CIK在培養(yǎng)不同時(shí)間（10天，15天，20天）的細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定，結(jié)果證明隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化，細(xì)胞表面標(biāo)志（CD3，CD16，CD56）的表達(dá)也發(fā)生變化，表達(dá)率逐步升高，分別達(dá)到42.1%，63.3%，77.1%，而對(duì)培養(yǎng)不同時(shí)間的CIK進(jìn)行殺傷活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也顯示殺傷率隨著時(shí)間逐漸增高，分別為10天，41.75%；15天，54.43%；20天，79.31%，與表面標(biāo)志的表達(dá)成正相關(guān)，各時(shí)間段殺傷活性比較有顯著差異（P＜0.01）。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，CIK細(xì)胞可以同時(shí)表達(dá)CD3＋CD56＋CD16＋膜蛋白分子，所以又被稱為NK細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞，因此具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性以及NK細(xì)胞非MHC限制性殺瘤的特點(diǎn)［1］，可以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行直接殺傷，也可以通過分泌多種抗腫瘤細(xì)胞因子，如IFN－γ、TNF－α、IL－2等調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)間接殺傷腫瘤細(xì)胞［2］，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，保證抗腫瘤活性的長(zhǎng)期持久。已有研究證明化療聯(lián)合CIK治療對(duì)多種腫瘤具有較好的療效［3］，而且沒有明顯的毒副反應(yīng)［4］，可以促進(jìn)患者免疫功能重建［5，6］。本實(shí)驗(yàn)以肺腺癌細(xì)胞A549作為研究對(duì)象，通過體外實(shí)驗(yàn)證明CIK對(duì)A549具有較強(qiáng)的殺傷效力，而且CIK的表達(dá)率與殺傷活性成正相關(guān)，為CIK治療腫瘤提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和支持。

［1］Shavit Y，Berr Eliyahu S，Zeidel A，et al.Effects of fentanyl on natural killer cell activity and on tumor metastasis in rats.Dose and timing study［J］.Neuoimmunodulation，2004，11（4）：255.

［2］Shablak A，Hawkins RE，Rothwell DG，et al.T cell－based immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma：Modest success and future perspective［J］.Clin Cancer Res，2009，15（21）：6503.

［3］Wu C，Jiang J，Shi L，et al.Prospective study of chemotherapy in combination with cytokine－induced killer cells in patients suffering from advanced non－small cell lung cancer［J］.Anticancer Res，2008，28（6B）：3997.

［4］Jiang JT，Shen YP，Wu J，et al.Increasing the frequency of CIK cells adoptive immunotherapy may decrease risk of death in gastric cancer patients［J］.World J Gastroenterol，201016（48）：6155.

［5］Jiang J，Xu N，Wu C，et al.Treatment of advanced gastric cancer by chemotherapy combined with autologous cytokine－induced killer cells［J］.Anticancer Res，2006，26（3B）：2237.

［6］Schmidt－Wolf IG，Lefterova P，Mesta BA，et al.Phenotypic characterization and identification of effector cell involved in tumor cell recognition of cytokine－induced killer cells［J］.Exp Hematol，1993，21（13）：1673.

Study of relationship of CIK cells phenotype change and its anti－tumor activity at different time

ZHAO Xin，CHANG Ying，LIU Yu－xia，et al.（Jilin Province Tumor Hospital，Changchun130012，China）

Objective To Explore the relationship of CIK cells（cytokine induced killer cells）phenotype change and its anti－tumor activity at different time，provide experimental data for the clinical application of CIK.Methods Isolated from human peripheral blood mononuclear cells，Plus IFNγ，IL1α，CD3Ab，IL－2and other cytokines induced CIK cells and identified，then，identified CIK with A549cells were co－cultured，detect different time cultured CIK immune phenotypic changes and on A549cells killing effects in vitro.Results Culture at different times（10days，15days，20days）of CIK cells CD3＋CD56＋CD16＋expression rates were 42.1%，63.3%，77.1%，Cytotoxicity against A549were 41.75%，54.43%，79.31%.Conclusion As the incubation time，CIK phenotype expression rate gradually increased，Killing efficiency of A549with the gradual enhancement，In this study，the cytotoxic activity of up to 20days，prompt that we can depending on the CIK immune phenotype expression choose to apply the time，achieve the best results.

CIK cells；Cell phenotype；Lung cancer cells A549；killing activity

R392

A

2014－03－19）

1007－4287（2015）09－1455－03

＊通訊作者