張嘉玲，鄭長軍，楊瑞琦，王 飛，范麗梅

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春130041）

重樓皂苷通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制荷瘤小鼠移植瘤生長

張嘉玲，鄭長軍，楊瑞琦，王 飛，范麗梅＊

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春130041）

目的 探討重樓皂苷Ⅶ聯(lián)合順鉑抑制荷瘤小鼠移植瘤生長的分子機(jī)制。方法 SKOV3細(xì)胞皮下接種NOD／SCID小鼠，待移植瘤形成后，荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組（n＝10）：對(duì)照組、低劑量重樓皂苷Ⅶ組（LD組）、中劑量重樓皂苷Ⅶ組（MD組）、高劑量重樓皂苷Ⅶ組（HD組）。15天后，分離腫瘤組織，測定腫瘤體積和重量及抑瘤率；TUNEL染色和Western blot檢測腫瘤細(xì)胞凋亡及其機(jī)制。結(jié)果 在HD組中，腫瘤重量抑制率達(dá)57.98%，體積抑制率達(dá)55.11%，細(xì)胞凋亡率達(dá)42.39%，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)重樓皂苷作用后，凋亡相關(guān)基因Bcl－2表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)增加；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因GRP78和CHOP表達(dá)均增加。結(jié)論 重樓皂苷能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且這種凋亡是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的。

重樓皂苷Ⅶ；移植瘤；凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1450）

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位，嚴(yán)重威脅女性的健康。目前臨床上卵巢癌的治療方案主要采用手術(shù)治療聯(lián)合化療等綜合治療，但其療效也受到一定限制。研究表明，重樓皂苷作為一種有效的中草藥具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用，其主要有效成份是重樓皂苷Ⅶ［1－3］。我們前期研究表明重樓皂苷Ⅶ可有效抑制人肺腺癌細(xì)胞A549增殖和卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，表明重樓皂苷Ⅶ具有良好的抗腫瘤作用。本研究聯(lián)合重樓皂苷Ⅶ和順鉑對(duì)接種SKOV3細(xì)胞的荷瘤小鼠進(jìn)行灌胃給藥，觀察重樓皂苷Ⅶ在體內(nèi)抑制腫瘤的效果，并明確其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SKOV3細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，在含10%胎牛血清中的IMDM培養(yǎng)液中，5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞在倒置顯微鏡下形態(tài)為細(xì)胞較大，貼壁生長，核大，細(xì)胞生長速度較慢。每隔3天傳代一次，待傳代細(xì)胞數(shù)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需量時(shí)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞配成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)活細(xì)胞濃度達(dá)到1×107個(gè)／ml，準(zhǔn)備接種裸鼠。

1.2 荷瘤小鼠模型建立

50只雄性NOD／SCID小鼠購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在無菌通風(fēng)環(huán)境中單籠飼養(yǎng)。接種部位為裸鼠右側(cè)腋部皮下，接種量為200μl卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3。接種后每天觀察移植瘤生長狀況，當(dāng)移植瘤長徑長至1cm左右時(shí)，準(zhǔn)備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物給藥

在所有荷瘤小鼠中，挑選40只移植瘤形成小鼠，隨機(jī)分為4組（n＝10）：對(duì)照組、低劑量重樓皂苷Ⅶ（50mg／kg）＋順鉑組（LD組）、中劑量重樓皂苷Ⅶ（250mg／kg）＋順鉑組（MD組）、高劑量重樓皂苷Ⅶ（500mg／kg）＋順鉑組（HD組）。在所有組中，順鉑用量為50mg／kg，對(duì)照組用生理鹽水代替。小鼠灌胃給藥，每天1次，共15天。15天后，處死小鼠，分離腫瘤組織，測定腫瘤體積和重量及抑瘤率。腫瘤體積等于V＝1／2（長徑×短徑2），重量抑瘤率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重／對(duì)照組平均瘤重）× 100%，體積抑瘤率（%）＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均體積／對(duì)照組平均體積）×100%。

1.4 TUNEL染色

腫瘤組織用10%福爾馬林固定24h后，制成石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟入水后，用羅氏公司TUNEL試劑盒進(jìn)行凋亡染色，具體操作按說明書進(jìn)行。之后，染色切片在400倍的光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算凋亡百分?jǐn)?shù)的平均數(shù)（average rate of apoptosis，ARA）。

1.5 Western blot

將100mg腫瘤組織置于液氮中研磨至粉末，加入裂解液，BCA法蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度至濃度為2.5μg／μL，震蕩混勻后，100℃煮5min，12 000g離心5min，上樣50μg，電泳條件：濃縮膠恒壓80V，約20min；分離膠恒壓100V。半干電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（30mA，90min）；5%脫脂奶粉封閉，之后加入羊抗鼠Bax、Bcl－2、兔抗鼠GRP78、CHOP一抗4℃過夜，TBST洗膜，添加HRP標(biāo)記的二抗，室溫輕搖30 min；然后加入ECL發(fā)光液，X線膠片曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 重樓皂苷抑瘤率

所有小鼠在實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束前均存活，存活率為100%。腫瘤剝離后稱取重量，測量腫瘤長徑和短徑，然后計(jì)算腫瘤體積。測量結(jié)果顯示低劑量重樓皂苷Ⅶ（LD組）能輕微抑制腫瘤生長，而中劑量和高劑量（MD和HD組）能有效抑制腫瘤生長，其重量抑制率達(dá)52%和57.98%，體積抑制率分別達(dá)45.12%和55.11%，重量和體積與對(duì)照組相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，表1）。

表1 重樓皂苷Ⅶ處理荷瘤小鼠后腫瘤重量和體積變化

2.2 重樓皂苷促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡

TUNEL染色檢測腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，在MD和HD組中，多數(shù)細(xì)胞核呈棕色顆粒，可見細(xì)胞表面?zhèn)巫愠霈F(xiàn)，微絨毛等消失，細(xì)胞皺縮，變形，體積變小，細(xì)胞核中染色質(zhì)濃縮，早期染色質(zhì)聚集于核膜邊呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂。LD組中凋亡細(xì)胞相對(duì)較少，與對(duì)照組相比沒有明顯差異。四組中細(xì)胞平均凋亡率（ARA）見圖1，其中，MD和HD組與對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖1 重樓皂苷Ⅶ處理荷瘤小鼠后腫瘤細(xì)胞凋亡率

2.3 凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl－2表達(dá)變化

Bax和Bcl－2基因是兩個(gè)重要的凋亡基因，Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl－2抑制細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示隨著重樓皂苷Ⅶ濃度的增加，Bcl－2表達(dá)減少，而Bax蛋白表達(dá)增加（圖2），提示經(jīng)重樓皂苷Ⅶ和順鉑聯(lián)合作用后，腫瘤生長受到抑制，這也與TUNEL染色結(jié)果一致。

2.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達(dá)

Western blot檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷處理移植瘤后，GRP78表達(dá)明顯上調(diào)，且存在劑量依賴效應(yīng)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，GRP78的上升也會(huì)引起上調(diào)CHOP的表達(dá)（圖3），從而介導(dǎo)凋亡，提示重樓皂苷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的。

圖2 Western blot檢測凋亡相關(guān)基因Bcl－2和Bax的表達(dá)

圖3 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因GRP78和CHOP的表達(dá)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅶ聯(lián)合順鉑能有效抑制移植瘤生長，且沒有任何副作用，提示重樓皂苷是一種具有抗腫瘤效應(yīng)的中藥成份。移植瘤細(xì)胞凋亡是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的，這也與我們體外實(shí)驗(yàn)相一致。顏［4］等發(fā)現(xiàn)重樓皂苷對(duì)10種腫瘤細(xì)胞株均有細(xì)胞毒作用，如人肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF－7、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29，人腎腺癌細(xì)胞A498等等，提示重樓皂苷具有廣譜的抗腫瘤效應(yīng)。重樓皂苷中活性成份較多，如重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等。有研究表明重樓皂苷I在體外能阻滯人肝癌SMMC－7721細(xì)胞株的生長并誘導(dǎo)其凋亡，說明重樓皂苷其中的單一成份也能有效抑制腫瘤生長［5］。我們的研究則認(rèn)為重樓皂苷Ⅶ是一種有效活性成份，在隨后的研究中，我們將比較重樓皂苷各成份之間抗腫瘤效應(yīng)的作用，確定最有效的成份。

目前研究表明，細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有密切關(guān)系。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能損傷則會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR）來保護(hù)這種細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能；但長期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡，消除受損細(xì)胞，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶glucose－regulated protein78（GRP78）、轉(zhuǎn)錄因子growth arrest and DNA－damage－inducible gene 153（GADD153／CHOP）等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)［6－8］。我們有研究結(jié)果表明重樓皂苷處理移植瘤后，GRP78和CHOP的表達(dá)均明顯上調(diào)，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)正在進(jìn)行。Bcl－2家族在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡中起著重要的作用，Bcl－2能夠抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡，而Bax的缺失可保護(hù)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡［9－11］。本研究結(jié)果也表明隨著重樓皂苷Ⅶ濃度的增加，Bcl－2表達(dá)減少，而Bax蛋白表達(dá)增加，提示Bcl－2家族參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究為臨床上治療卵巢癌提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有一定的臨床意義。

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Inhibition of tumor growth in tumor－bearing mice by polyphyllins via endoplasmic reticulum stress

ZHANG Jia－ling，ZHENG Chang－jun，YANG Rui－qi，et al.（The Second Hospital of Jilin University，Changchun130041，China）

Objective To investigate the molecular mechanism of inhibiting of tumor growth in tumor－bearing mice by polyphyllinⅦand cisplatin.Methods SKOV3cells were inoculated subcutaneously into NOD／SCID mice，and the tumor－bearing mice were randomly divided into four groups（n＝10）：the control group，low－dose of polyphyllinⅦgroup（group LD），medium－dose of polyphyllinⅦgroup（group MD），high－dose of polyphyllinⅦgroup（group HD）.15days later，the tumor tissues were isolated and measured volume and weight to calculate the tumor inhibition rate；the tumor cell apoptosis and its mechanism were determined by TUNEL staining and Western blot.Results In group HD，the weight inhibition rate was 57.98%，volume inhibition rate was 55.11%，and the apoptotic rate was 42.39%，there was a significant difference compared with the control group.After treatment of polyphyllinⅦ，the expression of Bcl－2 was decreased and the expression of Bax was increased；the expression of GRP78and CHOP，the endoplasmic reticulum－related gene，was increased too.Conclusion The polyphyllins could effectively promote the apoptosis of tumor cells via endoplasmic reticulum stress.

PolyphyllinⅦ；xenografted tumor；apoptosis；endoplasmic reticulum stress

R285.5

A

2014－03－22）

1007－4287（2015）09－1450－04

中國博士后基金資助（2013M541316）；吉林省衛(wèi)生廳科研課題（2013Z097）

＊通訊作者