朱娟 潘小英 吳菁 丁紅珂 何薇

(廣州醫(yī)科大學廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

X連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良一家系的產前診斷及遺傳咨詢

朱娟 潘小英 吳菁 丁紅珂 何薇*

(廣州醫(yī)科大學廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510010)

目的 對一X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良(XLHED)的家系進行EDA基因診斷，探討XLHED的產前診斷方法及遺傳咨詢。方法 提取先證者、孕婦外周血及胎兒羊水細胞DNA，應用聚合酶鏈反應(PCR)技術結合直接測序法檢測EDA基因，并進行針對性的遺傳咨詢及優(yōu)生指導。結果 孕婦為EDA基因7號外顯子c.871G>A雜合突變，先證者及胎兒均為EDA基因7號外顯子c.871G>A純合突變，孕婦經遺傳咨詢后根據倫理原則要求終止妊娠。結論 在本家系中，EDA基因c.871G>A突變?yōu)閷е耎-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良的原因，對EDA基因突變檢測可對XLHED進行產前診斷。

X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良; 基因突變; 產前診斷

Objective To investigate a procedure for genetic counseling and prenatal diagnosis of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia (XLHED) by mutation detection in a family with XLHED. Method Collected the peripheral blood and fetal amniotic fluid cells,EDAgene were amplified with polymerase chain reaction (PCR) technique and directly sequenced. Results Pregnant women appear forEDAgene 7 extra child c. 871 g>A hybrid mutation, the proband and fetus are 7 extraEDAgene show son c. 871 g>A homozygous mutations. Conclusions In this family,EDAgene 7 extra child c. 871 g>A mutations detection lead to XLHED,EDAgene mutation detection can make prenatal diagnosis for the XLHED. 【Key words】 X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia; gene mutation; prenatal diagnosis

外胚層發(fā)育不良(ectodermal dysplasia，ED) 是一種罕見的以汗腺、毛發(fā)及牙齒等外胚層組織發(fā)育不良或形態(tài)缺陷為主要特征的遺傳性疾病，出生發(fā)病率約為1∶100 000。X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良(X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia，XLHED)是ED中最常見的一種類型，為X染色體連鎖隱性遺傳疾病，其臨床表現為毛發(fā)稀少、汗腺發(fā)育不全、前額突出、無牙或少牙畸形、皮膚及其附屬器官異常[1]。XLHED患兒由于皮膚散熱系統(tǒng)異常，早期死亡率高達30%，余者可因環(huán)境溫度、日光照射及劇烈運動而導致高熱，嚴重影響工作、生活甚至威脅生命[2]。由于無有效治療方法，產前診斷是預防和減少XLHED患兒出生的有效措施。本文對1例散發(fā)XLHED患兒及其母親、高危胎兒應用聚合酶鏈反應(PCR)技術結合直接測序法檢測EDA基因，并對XLHED疾病進行遺傳咨詢和優(yōu)生指導，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 ①先證者：男，7歲，第一胎足月順產，出生后發(fā)現全身無汗，毛發(fā)稀少，無眉，鼻梁塌陷，劇烈運動后煩躁，常不明原因發(fā)熱，全身皮膚干燥，粗糙，牙齒四顆，尖錐樣，上下各兩個，智力發(fā)育正常，在外院診斷為“無汗性外胚層發(fā)育不良綜合征”。②孕婦：30歲，孕2產1宮內妊娠24周單活胎，為先證者母親，既往體健，全身皮膚毛發(fā)無異常，非近親婚配。孕期順利，定期產檢無特殊不適。③家系及其他成員：丈夫及家族中無類似病例發(fā)生。

1.2 研究方法 本研究經過本院醫(yī)學倫理委員會批準后，遵循非指令性原則，與先證者母親及父親進行XLHED病例的詳細咨詢，提供完備且無偏倚的信息后，先證者母親及父親均明確表示有避免再次生育XLHED患兒的愿望，遂告知其產前診斷的局限性及具體流程，簽署知情同意書，提取先證者、母親血樣進行EDA基因檢測。在明確先證者EDA基因突變位點后，詳細告知先證者母親及父親侵入性產前診斷的各種并發(fā)癥及風險，簽署手術同意書后抽取羊水進行EDA基因檢測。

1.2.1 實驗室方法1.2.1.1 基因組DNA提取 抽取先證者及母親靜脈血5 ml加入EDTA抗凝管，使用廈門致善核酸自動提取儀提取DNA。抽取胎兒羊水10 ml，使用Qiagen試劑盒進行DNA提取，并置于-20 ℃保存。1.2.1.2 引物設計及合成EDA基因編碼區(qū)有8個外顯子，共編碼391個氨基酸。根據文獻[3-5]設計8對特異性引物擴增EDA基因編碼區(qū)的8個外顯子，確認引物核酸序列，由深圳華大基因科技服務有限公司合成引物，見表1。

表1 EDA外顯子1-9 PCR擴增引物序列

1.2.1.3EDA基因檢測 對樣本進行常規(guī)PCR 擴增，反應總體積為25 μl，內含10×反應緩沖液，200 μmol/dNTP，上下游引物各50 ng，模板DNA100 ng，Taq 聚合酶1U。PCR反應條件: 預變性95 ℃ 5分鐘，95 ℃變性30秒，56～60 ℃復性30秒，72 ℃ 延伸30秒，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10分鐘。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測確認后，交由深圳華大基因科技服務有限公司純化后直接測序，測序結果提交PubMed-Blast與數據庫基因序列進行比較。

1.2.2 胎兒侵入性產前診斷

1.2.2.1 儀器設備 ALOKA1400 超聲儀，3.5 MHz穿刺探頭，采用22G 150 mm PTC穿刺針。1.2.2.2 羊膜腔穿刺術 孕婦取仰臥位，常規(guī)消毒后，在B超介導下經腹行羊膜腔穿刺提取胎兒羊水10 ml，術程順利。提取羊水DNA后，進行EDA基因診斷。

2 結 果

檢測者DNA使用8 對引物在各自條件下分別擴增出相應產物，基因突變測序結果顯示孕婦為EDA基因7號外顯子c.871G>A雜合子突變，先證者的EDA基因7號外顯子c.871G>A純合子突變，此位點的鳥嘌呤(G)被腺嘌呤(A)替換，導致EDA基因的第291位氨基酸密碼子GGC突變成GAC,導致正常的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代。胎兒的EDA基因測序結果顯示7號外顯子c.871G>A純合子突變，與先證者一樣均為XLHED患兒。此突變位點與Gene 數據庫公布的人類EDA基因核苷酸序列進行比對分析，結果見圖1～3。經過遺傳咨詢，孕婦及家屬要求根據倫理原則終止妊娠，引產出一男性胎兒。

圖1 先證者母親外顯子5的871位堿基突變反向測序圖

圖2 先證者外顯子5的871位堿基突變反向測序圖

圖3 胎兒外顯子5的871位堿基突變反向測序圖

3 討 論

3.1 病例分型及遺傳方式 外胚層發(fā)育不良(ED)分有汗型和無汗型兩種。有汗性外胚層發(fā)育(hidrotie ectodermal dysplasia，HED) 是一種常染色體遺傳疾病，其臨床表現為甲發(fā)育不良、掌跖角化過度、毛發(fā)稀疏或完全缺如等，但汗腺和皮脂腺功能正常[6]。無汗性外胚層發(fā)育不良多數為X-連鎖無汗性外胚層發(fā)育不良(XLHED)，男性發(fā)病，女性多為基因攜帶者，其臨床表現主要為無汗、脫發(fā)、缺牙三聯(lián)征[1，2]。本文家系的先證者具有典型臨床表現：全身無汗、毛發(fā)稀少、無眉、鼻梁塌陷、劇烈運動后煩躁、常不明原因發(fā)熱、全身皮膚干燥、粗糙、牙齒四顆，結合EDA基因結果及家系分析可臨床診斷為XLHED。XLHED為X染色體連鎖隱性遺傳疾病,傳遞給男性后代致病,傳遞給女性后代為雜合攜帶者,其遺傳規(guī)律如下：①XLHED男性患者與正常女性結婚，其兒子100%正常，其女兒100%為攜帶者。②正常男性與XLHED女性攜帶者結婚，其兒子50%正常，50%為患者；其女兒50%正常，50%為攜帶者。③XLHED男性患者與XLHED女性攜帶者結婚，其兒子50%正常，50%發(fā)??；其女兒50%為攜帶者，50%發(fā)病。④正常男性與XLHED女性患者結婚，其兒子100%為患者，女兒100%為攜帶者。本例家系中先證者母親為EDA基因攜帶者，先證者父親無異常，若其夫妻要求繼續(xù)生育，均需進行遺傳方式的咨詢及胎兒EDA基因產前診斷。

3.2 病因 XLHED的致病基因EDA定位于Xq12～13.1，其基因主要在外胚層中與角質、毛囊、汗腺等起源相關的細胞中表達，其編碼區(qū)共有8個外顯子，編碼的ectodysplasin-A蛋白含有391個氨基酸，為Ⅱ型三聚體單次跨膜蛋白，具有細胞內結構域、跨膜結構域、細胞外結構域、酶裂解結構域、膠原樣結構域及腫瘤壞死因子(TNF)同源結構域，在各個結構域編碼區(qū)均可發(fā)現EDA突變，至今報道各類突變已達200多種[7]。本研究中先證者與胎兒的EDA基因7號外顯子第871位點的鳥嘌呤(G)被腺嘌呤(A)轉換，使EDA基因的第291位氨基酸密碼子GGC突變成GAC，使正常的甘氨酸(Gly)被精氨酸(Arg)替代，此突變位于TNF同源結構域，會導致蛋白合成提前終止，從而影響了EDA基因編碼的ectodysplasin-A蛋白與相應受體的結合，中斷或消弱了正常外胚層上皮細胞信號通路，影響皮膚及其附屬物的正常發(fā)育[8]。

3.3 產前診斷 XLHED的患者由于汗腺發(fā)育不全，散熱困難，臨床上僅能通過物理方法對癥治療，病死率高，存活至成年者較少[2]，因此該病的產前診斷有重要意義。對有或疑有XLHED家族史的孕婦應進行遺傳咨詢，需對家族中的先證者、可能的攜帶者及孕婦進行家系分析及EDA基因診斷，明確家系中EDA突變位點后，方可對其胎兒進行產前診斷。同時需告知遺傳異質性，不排除臨床表現典型卻無法找出相關基因突變位點。除了通過侵入性產前診斷方法獲取臍血、羊水、絨毛進行EDA基因產前診斷外，有文獻報道可通過提取母親外周血中游離胎兒細胞進行EDA基因診斷[9]，也有報道在中孕晚期利用胎兒鏡行宮內胎兒皮膚活檢，取胎兒皮膚進行組織病理學分析[10]。當胎兒經過產前診斷確診為XLHED患兒時，需遵循知情同意及知情選擇原則，向孕婦及家屬提供真實、充分的信息，并進行有效的遺傳咨詢，同時需尊重孕婦及家屬的選擇。若其要求保留胎兒，應告知其在胎兒出生后需及早采取措施避免或減少高熱帶來的嚴重后遺癥的危害，并盡早治療。

本文對1例散發(fā)XLHED家系找出EDA基因突變位點并進行產前診斷，通過有效的遺傳咨詢及產前診斷是預防和減少XLHED患兒出生的有效措施。

[1] Prasun P, Karmarkar SA, Agarwal A,et al.Unusual physical features and heat strike presentation for hypohydrotic ectodermal dysplasia[J]. Clin Dysmorphol,2012,21(1):24-26.

[2] Mc Dermott, Casa DJ,Ganio MS, et al. Acute whole body cooling for exercise-induced hyperthermia:a systematic review[J].Jathl Train,2009,44(1):84-93.

[3] Canueto J, Zafra-Coboa MI, Ciria S, et al. A novel EDA gene mutation in a Spanish family with X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia[J].Actas Dermosifiliogr, 2011, 102(9): 722.

[4] Tong DX, He SP, Wang LW, et al. Association of single nucleotide polymorphisms in the cannabinoid receptor 2 gene with schizophrenia in the Han Chinese population[J].J Mol Neurosci, 2013, 51(2): 454.

[5] Zhang J, Han D, Song SJ, et al. Correlation between the phenotypes and genotypes of X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia and non-syndromic hypodontia caused by ectodysplasin-A mutations[J]. Eur J Med Genet, 2011, 54(4): e377.

[6] Mittal M, Srivastava D, Kumar A, et al. Dental management of hypohidrotic ectodermal dysplasia: A report of two cases[J]. Contemp Clin Dent, 201,6(3):414-417.

[7] Hsu MM, Chao SC, Lu AC. Gene Symbol: ED1. Disease: Ectodermal dysplasia, anhidrotic[J]. Hum Genet, 2004, 114: 609.

[8] Fan HL, Ye XQ, Shi L, et al. Mutations in the EDA gene are responsible for X-linked hypohidrotic ectodermal dysplasia and hypodontia in Chinese kindreds[J]. Eur J Oral Sci, 2008, 116(5): 412.

[9] Chen HP, Wang TR, Xu XY, et al. Comparison of three methods for the gene analysis of fetal cells from maternal peripheral blood[J]. Chin Med J, 2004, 117:507-510.

[10] Arnold ML, Rauskolb R, Anton-Lamprecht I, et al. Prenatal diagnosis of anhidrotic ectodermal dysplasia[J]. Prenat Diagn, 1984, 4:85-98.

編輯：宋文穎

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