祝鐵鋼，孫金旭，朱會霞，葛曉楠，何新航，張宇豪

（河北衡水學院生命科學系，河北衡水053000）

靈芝是一種具有良好藥性的真菌，自古以來一直被作為中藥所使用，原因就在于靈芝在免疫力、護肝、降低血糖膽固醇、腫瘤防治等方面有明顯的改良作用，免疫力方面，靈芝可以提高機體免疫力，增強機體的抵抗能力；保肝護肝方面，可以保護肝臟維持其正常解毒功能；血糖膽固醇方面，可以降低血糖和膽固醇防治糖尿病與脂肪肝等疾病；另外，靈芝在抗腫瘤方面也具有一定的功效[1-2]。1982年Kubota[3]首次從靈芝當中分離得到靈芝酸，但是國內靈芝酸的研究起步較晚，國內首次相關報道起始于陳國良[4]關于靈芝酸研究進展的綜述。雖然，靈芝酸有良好的藥用價值，但靈芝酸的產(chǎn)量較低。20世紀80年代，開始注重靈芝深層發(fā)酵代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)以及其組成成分的研究[5]。

近年來關于靈芝酸的研究主要集中在分離純化、化學結構和活性等方面[6]，但關于通過靈芝酸發(fā)酵條件優(yōu)化來提高產(chǎn)量的研究較少，因此就靈芝酸發(fā)酵條件中的葡萄糖、酵母膏、VB1、溫度、轉速、裝液量、誤差進行了深入研究以提高靈芝酸的產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

靈芝，由衡水學院生物系微生物實驗室提供。

95%乙醇，氯仿，NaHCO3，鹽酸，乙酸，乙腈。

1.2 儀器

Agilent1100高效液相色譜：美國安捷倫有限公司；EV311旋蒸儀：萊伯泰科有限公司；JA1203電子天平：上海田宮稱重制造有限公司。

1.3 樣品等處理方法

1.3.1 靈芝酸標準液處理

準確秤取靈芝酸標準品10 mg，放入容積為100mL的容量瓶中，乙醇稀釋至刻度，配置成濃度為1 mg/L的標準溶液，4℃冷藏備用。

1.3.2 靈芝酸的提取處理

適量秤取靈芝子實體，95%乙醇進行超聲輔助提取，料液比例為 1∶20（mg/mL）；提取溫度，70℃；浸提時間12 h，浸提后過濾，取濾液，真空薄膜旋蒸處理，真空濃縮至干，得到提取物浸膏，該浸膏用氯仿溶解，反復用水萃取5次，取氯仿層，過濾，取濾液，用飽和NaHCO3溶液萃取3次，取NaHCO3萃取層，3次用鹽酸調節(jié)至溶液pH為2～3之間，取沉淀物，沉淀物用氯仿溶解，真空薄膜旋蒸處理，濃縮至干，得到粗靈芝酸。

1.4 HPLC測定條件[7]

HPLC法測定靈芝中靈芝酸產(chǎn)量條件為：色譜柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6×250 mm）；流動相為 2%乙酸：2%乙腈（體積比為 7∶3）；流速 0.3 mL/min；進樣量10 μL外標法定量；柱溫30℃；檢測波長254 nm。

1.5 正交試驗設計

選用葡萄糖、酵母膏、VB1、溫度、轉速、裝液量和誤差作為影響因素，各取3個水平，進行L18（37）正交試驗，見表1。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for medium optimization

2 結果與討論

靈芝在免疫力、護肝、降低血糖膽固醇、腫瘤防治等方面有明顯的改良作用，因此，關于提高靈芝酸產(chǎn)量的研究也逐漸成為了科研熱點之一，由于不同的發(fā)酵條件對靈芝酸產(chǎn)量有較大的影響，因此可以通過正交試驗優(yōu)化試驗條件可以得出最佳因素組合，試驗安排見表1，試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 靈芝酸發(fā)酵條件正交試驗結果表Table 2 Results of orthogonal test for fermentation conditions optimization

表3 靈芝酸發(fā)酵條件正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization

由表2和表3可以得出培養(yǎng)基成分當中酵母膏差異顯著、培養(yǎng)條件當中溫度差異顯著，說明酵母膏和溫度兩個因素對靈芝酸的產(chǎn)量影響顯著；其中7個因素當中影響程度從大到小依次為酵母膏、溫度、轉速、葡萄糖、裝液量、VB1和誤差。對于3個不同水平比較而言，分別在 A2、B3、C3、D1、E2、F2、G2下靈芝酸產(chǎn)量最高。所以最佳試驗方案為葡萄糖20 g/L，酵母膏1.5 g/L，VB10.02 mg/L，溫度為 26℃，轉速 150 r/min，裝液量100mL/500mL。與金德寬[8]發(fā)表的靈芝酸工藝發(fā)酵條件的優(yōu)化結果對比可以得出，轉速均為150 r/min，裝液量均為100 mL，試驗結果一致，但在金德寬試驗結果中溫度為30℃，本試驗結果溫度為26℃，存在一定差異，但差異不顯著；在A2B3C3D1E2F2G2下最高產(chǎn)量為1.68 g/L，未優(yōu)化前靈芝酸產(chǎn)量為1.26 g/L，經(jīng)過優(yōu)化后產(chǎn)量增加0.42 g/L。另外在各試驗組合中可以看出，各試驗結果靈芝酸產(chǎn)量從大到小依次6＞12＞14＞18＞15＞ 3＞2＞ 11＞9 ＞4＞16＞17＞13＞ 7＞10 ＞1＞8＞5。

3 結論

以酵母膏、溫度、轉速、葡萄糖、裝液量、VB1和誤差為7個影響因素，以靈芝酸為目的產(chǎn)物設計了L18（37）正交試驗，并進行相關的方差分析結果得出靈芝酸的適宜條件為：葡萄糖20g/L，酵母膏1.5g/L，VB10.02mg/L，溫度為26℃，轉速150 r/min，裝液量100 mL/500 mL。

[1] 蔣婷婷.靈芝三萜類成分的研究進展[J].海峽藥學,2012(1):1-2

[2] 楊錦生.靈芝主要化學成分及其藥理作用研究述評[J].中華中醫(yī)藥學刊,2012(4):1-3

[3] Kubora T,Asaka Y,Miura I,et al.Structures of Ganoderic A and B,two new 1anostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum(Fr)Karst[J].Helv Chim Acta,1982,65(2):611-619

[4] 陳國良,陳曉清.靈芝有效成分研究綜述[J].中國食用菌,1995,14(4):7-9

[5] 李民,陳長慶.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進展[J].生物工程進展,2000,20(2):26-30

[6] 林志彬.靈芝現(xiàn)代研究[M].北京:北京醫(yī)科大學出版社,2001:21-25

[7] 鄢嫣,聶少平,陳奕.靈芝氯仿提取物的HPLC指紋圖譜的研究[J].食品與生物技術學報,2009,28(5):589-593

[8] 金德寬.靈芝酸發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化[J].中國釀造,2011(9):1-6