劉啟勝，程正位

0 引言

腸缺血再灌注損傷是臨床上常見的危重事件，常伴發(fā)于腹部外傷、失血性休克、腸移植、嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、燒傷等病理和手術(shù)狀態(tài)下［1-2］。其發(fā)病機(jī)制包括炎癥、凋亡、壞死等，但其具體機(jī)制目前依然不清楚［3-4］。PPAR-γ激動劑羅格列酮因其卓越的降糖作用而被廣泛用于臨床，最近研究發(fā)現(xiàn)，其不但有降糖作用，還具有明顯的抗炎作用［4-5］，而炎癥是腸缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機(jī)制［6-8］。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠腸系膜上動脈(SMA)夾閉模型，研究靜脈注射羅格列酮對腸道缺血再灌注損傷后的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和動物 羅格列酮(Sigma，USA)，水合氯醛(Google生物)。TLR-4(CST，USA)，p-p65(CST，USA)，p65(CST，USA)，PPAR-γ(CST，USA)，p-PPAR-γ(CST，USAP)，βactin(abgent，USA)，TRIzol reagent(Invitrogen，USA)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia，USA)，SYBR green(Takara，Japan)，qPCR 引物(擎科生物技術(shù)有限公司，序列見表1)，ELISA試劑盒購自于eB-science，HE試劑由溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室配制。紫外分光光度計(jì)(Thermo fisher)，逆轉(zhuǎn)錄儀(eppendorf)，qPCR儀(BIO-RAD IQ5)，顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均由四川省人民醫(yī)院病理科提供。SD大鼠，SPF級，北京華富康動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 動物模型的建立與分組 30只健康雄性SD大鼠，2月齡，平均體重220～250 g，合格證編號:103079。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、腸缺血再灌注損傷組(IRI組)和羅格列酮預(yù)處理組(RGZ組)，每組10只。RGZ組術(shù)前1 h給予羅格列酮靜脈注射(0.3 mg/kg)，劑量參考文獻(xiàn)［9］。Sham 組和 IRI組給予等體積靜脈注射生理鹽水;Sham組行假手術(shù)，IRI組和RGZ組行小腸缺血再灌注損傷手術(shù)。具體手術(shù)方式如下:大鼠在腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉狀態(tài)下，行腹部正中切口，鈍性分離腸系膜上動脈根部(SMA)，用微血管夾夾閉SMA根部，完全阻斷血流45 min后松開血管夾，恢復(fù)腸道血流形成再灌注?？p合腹部，再灌注4 h后處死大鼠，收集標(biāo)本。Sham組操作同上，但開腹后不夾閉腸系膜上動脈。

表1 實(shí)時定量PCR檢測的引物序列

1.3 腸道組織學(xué)檢查 小腸組織切片經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋、PAS染色之后，在光鏡下觀察小腸組織病理學(xué)變化。小腸損傷程度用Cuzzocrea等［9］報道的積分法評估。0分為正常絨毛和腺體;1分為部分絨毛頂部上皮輕度受損;2分為上皮下腺體輕度受損;3分為上皮下間隙擴(kuò)大，毛細(xì)血管充血;4分為上皮與固有層中度分離，腺體受損;5分為部分絨毛頂部脫落;6分為絨毛脫落明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張;7分為固有層絨毛脫落，腺體受損明顯;8分為固有層開始消化分解;9分為出血、潰瘍。

1.4 Western印跡檢測 取小腸組織于精微天平稱重，按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液，冰上勻漿，裂解30 min后，4℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質(zhì)的上樣量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，后轉(zhuǎn)膜，然后洗膜，以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h，PPAR-γ(1∶1 000)、p-PPAR-γ(1∶500)、p65(1∶1 000)、pp65(1∶1 000)、TLR-4(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學(xué)發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白，并拍照。以Quantity one對條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結(jié)果。

1.5 實(shí)時定量 PCR(RT-PCR)檢測 IL-6、TNF-α和IFN-γ 稱取適量小腸組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測量濃度，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行。以管家基因β-actin作為內(nèi)參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2－ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量。

1.6 ELISA檢測血清IL-6、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中 IL-6、TNF-α 和 IFN-γ表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行資料分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示，資料采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理對缺血再灌注損傷小腸組織結(jié)構(gòu)的影響 光鏡下觀察腸道組織病理學(xué)變化，可見Sham組腸道黏膜細(xì)胞排列基本整齊，結(jié)構(gòu)完整，無組織壞死、缺失及水腫。腸缺血再灌注組可見小腸黏膜上皮下間隙擴(kuò)大，腺體受損及毛細(xì)血管充血、水腫，腸道組織有大量絨毛脫落、糜爛、炎性細(xì)胞浸潤、腸道組織結(jié)構(gòu)破壞。羅格列酮預(yù)處理治療可以減輕缺血再灌注損傷導(dǎo)致的病理損傷。各組小腸缺血再灌注損傷程度見圖1。

2.2 RGZ預(yù)處理對 PPAR-γ激活的影響 與Sham組比較，IRI組 p-PPAR-γ表達(dá)明顯增高(P＜0.01)，但 PPAR-γ表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。與IRI組比較，經(jīng)RGZ預(yù)處理的RGZ組p-PPAR-γ表達(dá)進(jìn)一步升高(P＜0.05)。見圖2。

2.3 RGZ預(yù)處理對TLR-4激活的作用 與Sham組比較，IRI組TLR-4表達(dá)明顯增高(P＜0.001)，與IRI組比較，RGZ組TLR-4表達(dá)明顯減低(P＜0.05)。見圖3。

圖1 RGZ預(yù)處理對腸缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腸組織病理改變的影響(10只/組)(400×)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

圖2 RGZ預(yù)處理對PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

2.4 RGZ預(yù)處理對NF-κB的影響 與Sham組比較，IRI組p-p65表達(dá)明顯增高(P＜0.001)，但p65表達(dá)無明顯差異(P＞0.05)。與IRI組比較，經(jīng)RGZ預(yù)處理的RGZ組，p-p65表達(dá)明顯減低(P＜0.05)。但p65表達(dá)依然無明顯差異(P＞0.05)。見圖4。

2.5 RGZ預(yù)處理對促炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-6表達(dá)的影響 炎癥因子是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要影響因素。實(shí)時定量PCR檢測顯示，IRI組與Sham 組比較，TNF-α、IFN-γ和IL-6mRNA表達(dá)水平明顯增高(P＜0.001)，RGZ組與Sham組比較，TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA 表達(dá)水平明顯降低(10只/組)(P＜0.05)。見圖5。

圖3 RGZ預(yù)處理對TLR-4蛋白表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

2.6 RGZ預(yù)處理對TNF-α、IFN-γ和IL-6分泌的影響 ELISA檢測顯示，與 IRI組比較，IRI組TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 分泌明顯增高(P ＜0.001)，與 Sham 組比較，RGZ 組 TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA分泌明顯降低(P＜0.05)，見圖6。

圖4 RGZ預(yù)處理對p65蛋白表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

圖5 RGZ預(yù)處理對TNF-α(A)、IL-6(B)和IFN-γ(C)mRNA表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

圖6 RGZ 預(yù)處理對 TNF-α(A)、IL-6(B)和 IFN-γ(C)的影響(10 只/組)注:與 IRI組比較，*P ＜0.05，＊＊＊P ＜0.001

3 討論

腸缺血再灌注損傷是腸道缺血后恢復(fù)血液循環(huán)難以避免的一種損傷，好發(fā)于腸移植、休克、腸梗阻等疾病，常導(dǎo)致非常嚴(yán)重的后果［1-3］。其發(fā)病機(jī)制包括炎癥、凋亡、壞死等，但具體機(jī)制目前依然不明［6-8］。

近年來的研究表明，炎癥在腸I/R的發(fā)病過程中起重要的作用［6］。腸I/R可顯著提高內(nèi)毒素攻擊的敏感性、可使機(jī)體單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，從而引發(fā)SIRS、甚至MODS［6］。因此，削弱炎癥是減輕腸缺血再灌注損傷的有效途徑之一。

TLR-4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路在腸缺血再灌注損傷發(fā)揮重要作用［10］。NF-κB激活取決于其亞單位p65的激活［11］。羅格列酮為過氧化物酶增殖酶受體(PPAR-γ)激動劑之一，因其具有廣泛的降糖作用而廣泛用于臨床［4-5］。最近研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ 激活可以調(diào)節(jié) TLR-4/NF-κB 信號通路［12］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腸缺血再灌注損傷可引起腸道充血、水腫、出血、壞死，腸腔內(nèi)可見糜爛、出血及潰瘍，腸腺上皮細(xì)胞水腫、壞死脫落。羅格列酮預(yù)處理能明顯減輕上述癥狀，減輕IRI導(dǎo)致的腸道病理變化，對腸道機(jī)械屏障也具有明顯的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，腸 I/R 后，TNF-α、IL-6、IFN-γ 等促炎癥細(xì)胞因子均明顯升高;羅格列酮預(yù)處理可明顯抑制 I/R 導(dǎo)致的 TNF-α、IL-6、IFN-γ促炎癥因子表達(dá)水平升高，提示羅格列酮可抑制促進(jìn)抗炎因子的釋放，控制持續(xù)擴(kuò)大的炎癥反應(yīng)，防止腸黏膜局部及全身組織器官損傷，從而達(dá)到防治腸缺血再灌注損傷的目的。對羅格列酮在腸I/R抑制促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制研究顯示，羅格列酮預(yù)處理通過進(jìn)一步激活PPAR-γ，可以抑制腸I/R導(dǎo)致的TLR-4/NF-κB信號通路的激活。

［1］ Shen H，Kreisel D，Goldstein DR.Processes of sterile inflammation［J］.J Immunol，2013，191(6):2857-2863.

［2］ Kalyanaraman B.Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students:Oxidants，antioxidants and disease mechanisms［J］.Redox Biology，2013，1(1):244-257.

［3］ Lenaerts K，Ceulemans LJ，Hundscheid IH，et al.New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury:implications for intestinal transplantation［J］.Curr Opin Organ Transplant，2013，18(3):298-303.

［4］ Mingfeng D，Xiaodong M，Yue L.Effects of PPAR-γ agonist treatment on LPS-induced mastitis in rats［J］.Inflammation，2014，37(6):1919-1924.

［5］ Deplanque D.Cell protection through PPAR nuclear receptor activation［J］.Therapie，2004，59:25-29.

［6］ Lamprecht G，Heininger A.Current aspects of sepsis caused by bacterial translocation［J］.Zentralbl Chir，2012，137(3):274-278.

［7］ Zickri MB，Embaby A，Metwally HG.Experimental study on the effect of intravenous stem cell therapy on intestinal ischemia reperfusion induced myocardial injury［J］.Int J Stem Cells，2013，6(2):121-128.

［8］ Haj B，Sukhotnik I，Shaoul R.Effect of ozone on intestinal recovery following intestinal ischemia-reperfusion injury in a rat［J］.Pediatr Surg Int，2013，5(3):111-113.

［9］ Cuzzocrea S，Pisano B，Dugo L，et al.Rosiglitazone and 15-deoxy-Delta12，14-prostaglandin J2，ligands of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma(PPAR-gamma)，reduce ischaemia/reperfusion injury of the gut［J］.Br J Pharmacol，2003，140(2):366-376.

［10］ Henry SD，Guarrera JV.Protective effects of hypothermic ex vivo perfusion on ischemia/reperfusion injury and transplant outcomes［J］.Transplant Rev(Orlando)，2012，26(2):163-175.

［11］ He GZ，Zhou KG，Zhang R，et al.The effects of n-3 PUFA and intestinal lymph drainage on high-mobility group box 1 and Toll-like receptor 4 mRNA in rats with intestinal ischaemia-reperfusion injury［J］.Br J Nutr，2012，108(5):883-892.

［12］ Dubuquoy L，Jansson EA，Deeb S，et al.Impaired expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in ulcerative colitis［J］.Gastroenterology，2003，124(5):1265-1276.