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        羅格列酮抑制TLR-4/NF-κB信號通路對腸缺血再灌注損傷的影響

        2015-05-07 06:50:36劉啟勝程正位
        實(shí)用藥物與臨床 2015年9期
        關(guān)鍵詞:列酮羅格絨毛

        劉啟勝,程正位

        0 引言

        腸缺血再灌注損傷是臨床上常見的危重事件,常伴發(fā)于腹部外傷、失血性休克、腸移植、嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、燒傷等病理和手術(shù)狀態(tài)下[1-2]。其發(fā)病機(jī)制包括炎癥、凋亡、壞死等,但其具體機(jī)制目前依然不清楚[3-4]。PPAR-γ激動劑羅格列酮因其卓越的降糖作用而被廣泛用于臨床,最近研究發(fā)現(xiàn),其不但有降糖作用,還具有明顯的抗炎作用[4-5],而炎癥是腸缺血再灌注損傷的重要發(fā)病機(jī)制[6-8]。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠腸系膜上動脈(SMA)夾閉模型,研究靜脈注射羅格列酮對腸道缺血再灌注損傷后的作用,并探討其可能的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑、儀器和動物 羅格列酮(Sigma,USA),水合氯醛(Google生物)。TLR-4(CST,USA),p-p65(CST,USA),p65(CST,USA),PPAR-γ(CST,USA),p-PPAR-γ(CST,USAP),βactin(abgent,USA),TRIzol reagent(Invitrogen,USA),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia,USA),SYBR green(Takara,Japan),qPCR 引物(擎科生物技術(shù)有限公司,序列見表1),ELISA試劑盒購自于eB-science,HE試劑由溫州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室配制。紫外分光光度計(jì)(Thermo fisher),逆轉(zhuǎn)錄儀(eppendorf),qPCR儀(BIO-RAD IQ5),顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均由四川省人民醫(yī)院病理科提供。SD大鼠,SPF級,北京華富康動物實(shí)驗(yàn)中心。

        1.2 動物模型的建立與分組 30只健康雄性SD大鼠,2月齡,平均體重220~250 g,合格證編號:103079。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,狀態(tài)良好,按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、腸缺血再灌注損傷組(IRI組)和羅格列酮預(yù)處理組(RGZ組),每組10只。RGZ組術(shù)前1 h給予羅格列酮靜脈注射(0.3 mg/kg),劑量參考文獻(xiàn)[9]。Sham 組和 IRI組給予等體積靜脈注射生理鹽水;Sham組行假手術(shù),IRI組和RGZ組行小腸缺血再灌注損傷手術(shù)。具體手術(shù)方式如下:大鼠在腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉狀態(tài)下,行腹部正中切口,鈍性分離腸系膜上動脈根部(SMA),用微血管夾夾閉SMA根部,完全阻斷血流45 min后松開血管夾,恢復(fù)腸道血流形成再灌注??p合腹部,再灌注4 h后處死大鼠,收集標(biāo)本。Sham組操作同上,但開腹后不夾閉腸系膜上動脈。

        表1 實(shí)時定量PCR檢測的引物序列

        1.3 腸道組織學(xué)檢查 小腸組織切片經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋、PAS染色之后,在光鏡下觀察小腸組織病理學(xué)變化。小腸損傷程度用Cuzzocrea等[9]報道的積分法評估。0分為正常絨毛和腺體;1分為部分絨毛頂部上皮輕度受損;2分為上皮下腺體輕度受損;3分為上皮下間隙擴(kuò)大,毛細(xì)血管充血;4分為上皮與固有層中度分離,腺體受損;5分為部分絨毛頂部脫落;6分為絨毛脫落明顯,毛細(xì)血管擴(kuò)張;7分為固有層絨毛脫落,腺體受損明顯;8分為固有層開始消化分解;9分為出血、潰瘍。

        1.4 Western印跡檢測 取小腸組織于精微天平稱重,按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液,冰上勻漿,裂解30 min后,4℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清,BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質(zhì)的上樣量,經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,后轉(zhuǎn)膜,然后洗膜,以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h,PPAR-γ(1∶1 000)、p-PPAR-γ(1∶500)、p65(1∶1 000)、pp65(1∶1 000)、TLR-4(1∶500)、β-actin(1∶3 000)單抗孵育過夜,再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑,Kodak化學(xué)發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白,并拍照。以Quantity one對條帶進(jìn)行定量分析,以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結(jié)果。

        1.5 實(shí)時定量 PCR(RT-PCR)檢測 IL-6、TNF-α和IFN-γ 稱取適量小腸組織,于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測量濃度,逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行。以管家基因β-actin作為內(nèi)參對照基因,用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計(jì)算相對表達(dá)量。

        1.6 ELISA檢測血清IL-6、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中 IL-6、TNF-α 和 IFN-γ表達(dá)水平。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行資料分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示,資料采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理對缺血再灌注損傷小腸組織結(jié)構(gòu)的影響 光鏡下觀察腸道組織病理學(xué)變化,可見Sham組腸道黏膜細(xì)胞排列基本整齊,結(jié)構(gòu)完整,無組織壞死、缺失及水腫。腸缺血再灌注組可見小腸黏膜上皮下間隙擴(kuò)大,腺體受損及毛細(xì)血管充血、水腫,腸道組織有大量絨毛脫落、糜爛、炎性細(xì)胞浸潤、腸道組織結(jié)構(gòu)破壞。羅格列酮預(yù)處理治療可以減輕缺血再灌注損傷導(dǎo)致的病理損傷。各組小腸缺血再灌注損傷程度見圖1。

        2.2 RGZ預(yù)處理對 PPAR-γ激活的影響 與Sham組比較,IRI組 p-PPAR-γ表達(dá)明顯增高(P<0.01),但 PPAR-γ表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。與IRI組比較,經(jīng)RGZ預(yù)處理的RGZ組p-PPAR-γ表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)。見圖2。

        2.3 RGZ預(yù)處理對TLR-4激活的作用 與Sham組比較,IRI組TLR-4表達(dá)明顯增高(P<0.001),與IRI組比較,RGZ組TLR-4表達(dá)明顯減低(P<0.05)。見圖3。

        圖1 RGZ預(yù)處理對腸缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腸組織病理改變的影響(10只/組)(400×)注:與 IRI組比較,*P <0.05,***P <0.001

        圖2 RGZ預(yù)處理對PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較,*P <0.05,**P <0.01

        2.4 RGZ預(yù)處理對NF-κB的影響 與Sham組比較,IRI組p-p65表達(dá)明顯增高(P<0.001),但p65表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。與IRI組比較,經(jīng)RGZ預(yù)處理的RGZ組,p-p65表達(dá)明顯減低(P<0.05)。但p65表達(dá)依然無明顯差異(P>0.05)。見圖4。

        2.5 RGZ預(yù)處理對促炎癥因子TNF-α、IFN-γ和IL-6表達(dá)的影響 炎癥因子是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要影響因素。實(shí)時定量PCR檢測顯示,IRI組與Sham 組比較,TNF-α、IFN-γ和IL-6mRNA表達(dá)水平明顯增高(P<0.001),RGZ組與Sham組比較,TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA 表達(dá)水平明顯降低(10只/組)(P<0.05)。見圖5。

        圖3 RGZ預(yù)處理對TLR-4蛋白表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較,*P <0.05,***P <0.001

        2.6 RGZ預(yù)處理對TNF-α、IFN-γ和IL-6分泌的影響 ELISA檢測顯示,與 IRI組比較,IRI組TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 分泌明顯增高(P <0.001),與 Sham 組比較,RGZ 組 TNF-α、IFN-γ 和 IL-6 mRNA分泌明顯降低(P<0.05),見圖6。

        圖4 RGZ預(yù)處理對p65蛋白表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較,*P <0.05,***P <0.001

        圖5 RGZ預(yù)處理對TNF-α(A)、IL-6(B)和IFN-γ(C)mRNA表達(dá)的影響(10只/組)注:與 IRI組比較,*P <0.05,***P <0.001

        圖6 RGZ 預(yù)處理對 TNF-α(A)、IL-6(B)和 IFN-γ(C)的影響(10 只/組)注:與 IRI組比較,*P <0.05,***P <0.001

        3 討論

        腸缺血再灌注損傷是腸道缺血后恢復(fù)血液循環(huán)難以避免的一種損傷,好發(fā)于腸移植、休克、腸梗阻等疾病,常導(dǎo)致非常嚴(yán)重的后果[1-3]。其發(fā)病機(jī)制包括炎癥、凋亡、壞死等,但具體機(jī)制目前依然不明[6-8]。

        近年來的研究表明,炎癥在腸I/R的發(fā)病過程中起重要的作用[6]。腸I/R可顯著提高內(nèi)毒素攻擊的敏感性、可使機(jī)體單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞處于致敏狀態(tài)。激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生和釋放各種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì),使細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡,從而引發(fā)SIRS、甚至MODS[6]。因此,削弱炎癥是減輕腸缺血再灌注損傷的有效途徑之一。

        TLR-4/NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路在腸缺血再灌注損傷發(fā)揮重要作用[10]。NF-κB激活取決于其亞單位p65的激活[11]。羅格列酮為過氧化物酶增殖酶受體(PPAR-γ)激動劑之一,因其具有廣泛的降糖作用而廣泛用于臨床[4-5]。最近研究發(fā)現(xiàn),PPAR-γ 激活可以調(diào)節(jié) TLR-4/NF-κB 信號通路[12]。

        實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腸缺血再灌注損傷可引起腸道充血、水腫、出血、壞死,腸腔內(nèi)可見糜爛、出血及潰瘍,腸腺上皮細(xì)胞水腫、壞死脫落。羅格列酮預(yù)處理能明顯減輕上述癥狀,減輕IRI導(dǎo)致的腸道病理變化,對腸道機(jī)械屏障也具有明顯的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn),腸 I/R 后,TNF-α、IL-6、IFN-γ 等促炎癥細(xì)胞因子均明顯升高;羅格列酮預(yù)處理可明顯抑制 I/R 導(dǎo)致的 TNF-α、IL-6、IFN-γ促炎癥因子表達(dá)水平升高,提示羅格列酮可抑制促進(jìn)抗炎因子的釋放,控制持續(xù)擴(kuò)大的炎癥反應(yīng),防止腸黏膜局部及全身組織器官損傷,從而達(dá)到防治腸缺血再灌注損傷的目的。對羅格列酮在腸I/R抑制促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制研究顯示,羅格列酮預(yù)處理通過進(jìn)一步激活PPAR-γ,可以抑制腸I/R導(dǎo)致的TLR-4/NF-κB信號通路的激活。

        [1] Shen H,Kreisel D,Goldstein DR.Processes of sterile inflammation[J].J Immunol,2013,191(6):2857-2863.

        [2] Kalyanaraman B.Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students:Oxidants,antioxidants and disease mechanisms[J].Redox Biology,2013,1(1):244-257.

        [3] Lenaerts K,Ceulemans LJ,Hundscheid IH,et al.New insights in intestinal ischemia-reperfusion injury:implications for intestinal transplantation[J].Curr Opin Organ Transplant,2013,18(3):298-303.

        [4] Mingfeng D,Xiaodong M,Yue L.Effects of PPAR-γ agonist treatment on LPS-induced mastitis in rats[J].Inflammation,2014,37(6):1919-1924.

        [5] Deplanque D.Cell protection through PPAR nuclear receptor activation[J].Therapie,2004,59:25-29.

        [6] Lamprecht G,Heininger A.Current aspects of sepsis caused by bacterial translocation[J].Zentralbl Chir,2012,137(3):274-278.

        [7] Zickri MB,Embaby A,Metwally HG.Experimental study on the effect of intravenous stem cell therapy on intestinal ischemia reperfusion induced myocardial injury[J].Int J Stem Cells,2013,6(2):121-128.

        [8] Haj B,Sukhotnik I,Shaoul R.Effect of ozone on intestinal recovery following intestinal ischemia-reperfusion injury in a rat[J].Pediatr Surg Int,2013,5(3):111-113.

        [9] Cuzzocrea S,Pisano B,Dugo L,et al.Rosiglitazone and 15-deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2,ligands of the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma(PPAR-gamma),reduce ischaemia/reperfusion injury of the gut[J].Br J Pharmacol,2003,140(2):366-376.

        [10] Henry SD,Guarrera JV.Protective effects of hypothermic ex vivo perfusion on ischemia/reperfusion injury and transplant outcomes[J].Transplant Rev(Orlando),2012,26(2):163-175.

        [11] He GZ,Zhou KG,Zhang R,et al.The effects of n-3 PUFA and intestinal lymph drainage on high-mobility group box 1 and Toll-like receptor 4 mRNA in rats with intestinal ischaemia-reperfusion injury[J].Br J Nutr,2012,108(5):883-892.

        [12] Dubuquoy L,Jansson EA,Deeb S,et al.Impaired expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in ulcerative colitis[J].Gastroenterology,2003,124(5):1265-1276.

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