王晨曦，林其德

導(dǎo)致自然流產(chǎn)的根本原因之一可能是滋養(yǎng)細(xì)胞的缺血、缺氧及血管重鑄障礙。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，母胎界面Notch受體(Notch1－4)的異常表達(dá)可能誘導(dǎo)自然流產(chǎn)的發(fā)生［1－2］。Notch1/Jagged1 在晚期妊娠子癇前期胎盤組織中表達(dá)下調(diào)［3］，可能在早期就影響滋養(yǎng)細(xì)胞的分化、浸潤(rùn)、絨毛胎盤的血管形成，故本研究進(jìn)一步檢測(cè)了Jagged1在早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達(dá)，以了解Jagged1蛋白是否參與自然流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展過程。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2011年12月至2013年2月在解放軍第四一一醫(yī)院計(jì)劃生育門診就診的患者，經(jīng)患者知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意行絨毛標(biāo)本采集。15例自然流產(chǎn)患者為自然流產(chǎn)組，平均年齡(28.2±1.93)歲，平均孕周(7.06±1.58)周，B超顯示無胚芽或無胎心搏動(dòng)伴陰道流血;20例正常早期妊娠患者為正常妊娠組，自愿要求中止妊娠，平均年齡(26.12±2.58)歲，平均孕周(7.03±1.02)周，B超顯示有胚胎心血管博動(dòng)，無不良妊娠史。2組患者的年齡和孕周比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

1.2 方法 (1)標(biāo)本采集:無菌采集上述2組的離體絨毛，PBS洗凈血液，一半用4%多聚甲醛固定24～48 h后，常規(guī)石蠟包埋;另一半放入焦炭酸二乙酯(DEPC)處理的冷凍管中，置－80℃冰箱保存，用于RNA抽提和蛋白質(zhì)提取。(2)引物與探針:根據(jù)Gene Bank提供的Jagged1和GAPDH基因mRNA序列，采用ABI Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物和TAMRA探針，由上海英駿生物技術(shù)有限公司和上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見文獻(xiàn)［3］。(3)實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rea1－time RT－PCR):按照RNA抽提試劑盒和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Invitrogen和Toyobo Biotech公司)說明進(jìn)行 RNA抽提和 cDNA合成［3］。(4)免疫印跡法檢測(cè)(Western－b1ot):取凍存管中絨毛組織約100 mg，加入 200 ～1 000 μ1總蛋白抽提液，嚴(yán)格按照蛋白免疫印跡操作步驟進(jìn)行。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品蛋白的相對(duì)含量［3］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間差異比較采用F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自然流產(chǎn)組與正常妊娠組絨毛Jagged1蛋白的免疫定位 妊娠早期Jagged1蛋白主要在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿中表達(dá)。在自然流產(chǎn)組絨毛組織中呈弱陽性表達(dá)，較正常妊娠組略減弱。見圖1。

注:A為正常妊娠組;B為自然流產(chǎn)組

1 2組患者絨毛組織Jagged1蛋白的免疫定位(HE染色)

2.2 自然流產(chǎn)組與正常妊娠組絨毛Jagged1mRNA的表達(dá) Rea1－time PCR結(jié)果以2－ΔΔCt比值來表示。正常妊娠組絨毛組織中 Jagged1mRNA的2－ΔΔCt水平為(0.0623±0.0007)，明顯高于自然流產(chǎn)組的(0.0315±0.0065)，約為自然流產(chǎn)組的1.97倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 自然流產(chǎn)組與正常妊娠組絨毛Jagged1蛋白的表達(dá) 2組絨毛組織中Jagged1蛋白的表達(dá)，以目的蛋白條帶與β－actin條帶吸光度相對(duì)比值表示樣本的相對(duì)含量。Western－b1ot分析顯示，正常妊娠組絨毛組織中Jagged1表達(dá)水平為0.67±0.24，自然流產(chǎn)組為0.59±0.18，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

妊娠早期滋養(yǎng)細(xì)胞適時(shí)、適量增殖、分化、遷移、浸潤(rùn)、凋亡是胚胎著床和胎盤形成的關(guān)鍵，母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)子宮內(nèi)膜的過程類似于惡性腫瘤的侵襲，這一過程受滋養(yǎng)細(xì)胞和局部微環(huán)境的精細(xì)調(diào)節(jié)，從而達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。Notch受體或配體蛋白的激活可能啟動(dòng)滋養(yǎng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的“對(duì)話”，促母胎界面新生血管形成。Notch受體與鄰近細(xì)胞表面的配體結(jié)合后，可激活Notch信號(hào)通路。在大多數(shù)對(duì)惡性腫瘤的研究［4－6］中都表現(xiàn)為 Notch受體和配體分子表達(dá)失調(diào)以及Notch信號(hào)的異常激活。Jagged1參與調(diào)控許多組織的生長(zhǎng)發(fā)育，在造血、肌肉形成、神經(jīng)和血管發(fā)生等過程中起重要作用。研究顯示［7－8］，Jagged1 在腫瘤組織中多呈高表達(dá)，提示與惡性腫瘤侵襲性增強(qiáng)、預(yù)后不良有關(guān)，可作為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。

Jagged1是哺乳動(dòng)物組織中第一個(gè)被證實(shí)的Notch受體的配體，通過與鄰近細(xì)胞表面Notch的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合而觸發(fā)Notch信號(hào)通路，為單次跨膜糖蛋白，屬于 DSL(De1ta，Serrate，Lag－2)蛋白家族，胞外區(qū)具有2個(gè)保守序列，即1個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域(systeine－rich，CR)也就是結(jié)合Notch受體所必需的DSL基序，和16個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(epiderma1 growth factor，EGF)樣重復(fù)區(qū)。人類Jagged1基因定位于染色體20p12，全長(zhǎng)5.94 kb，ORF編碼3 657個(gè)氨基酸，與大鼠Jagged1的胞外區(qū)有98%的同源性。在早期胚胎發(fā)育的血管形成中，Notch基因起著關(guān)鍵性的作用，Jagged1可引發(fā)附近血管細(xì)胞中Notch的活化并促進(jìn)新生血管的形成，可能作為癌基因影響細(xì)胞的浸潤(rùn)能力和抑制新生血管的發(fā)生［9－10］。小鼠Jagged1突變引起血管發(fā)育缺陷，導(dǎo)致胚胎死亡［11］。在臨床中可見，部分自然流產(chǎn)患者B超提示在胚囊或胚芽階段缺乏心管搏動(dòng)出現(xiàn)胚胎停育，或者胚胎心管搏動(dòng)從有到無，提示胚胎早期血供不足或心血管發(fā)育障礙是自然流產(chǎn)的病因之一。Herr［12］的研究結(jié)果顯示，Jagged1在人類胎盤血管形成和分化過程中起潛在的關(guān)鍵性的作用。

Notch蛋白的調(diào)控異?？赡茉斐赡柑ソ缑孀甜B(yǎng)細(xì)胞促血管樣結(jié)構(gòu)形成能力的受限。筆者的前期研究［1－3］結(jié)果提示，Notch 蛋白可能由于其配體和受體在母胎界面表達(dá)的異常，直接影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)功能，阻礙了母胎界面新生血管的形成，可造成病理妊娠的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示Jagged1蛋白在自然流產(chǎn)絨毛組織中的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，提示Jagged1可能與血管形成障礙(血管生成減少或血管穩(wěn)定性差)有關(guān)，從而造成滋養(yǎng)細(xì)胞和胎盤組織缺血缺氧，誘導(dǎo)并參與了自然流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展過程。

［1］ 王晨曦，林建華，林其徳，等.早期自然流產(chǎn)患者絨毛Notch受體mRNA和蛋白表達(dá)及與妊娠關(guān)系的初步探討［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2008，17(9):651－653.

［2］ 王晨曦，林其徳，戴良圖，等.Notch1蛋白在正常妊娠早中晚期胎盤絨毛中的表達(dá)變化及其意義［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2013，22(3):199－201.

［3］ 王晨曦，林其徳，梁阿娟，等.子癇前期患者胎盤組織中Notch1、Jagged1 mRNA和蛋白的表達(dá)及其意義［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44(8):610－612.

［4］ Schreck KC，Tay1or P，Marchionni L，et a1.The Notch target Hes1 direct1y modu1ates G1i1 expression and Hedgehog sign1ing:a potentia1 mechanism of therapeutic resistance［J］.C1in Cancer Res，2010，16(24):6060－6070.

［5］ Meng RD，Shet1ton CC，Li YM，et a1.Gamma－secretase inhibitors abrogate oxa1ip1atin – induced activation of the Notch1 signa－1ing pathway in co1on cancer ce11s resu1ting in enhanced chemosensitivity［J］.Cancer Res，2009，69(2):573－582.

［6］ Wang C，Qi R，Li N，et a1.Notch1 signa1ing sensitizes tumor necrosis factor－re1ated apoptosis－inducing 1igand－induced apoptosis in human hepatoce11u1ar carcinoma ce11s by inhibiting Akt/Hdm2 mediated p53 degradation and up regu1ating p53 dependent DR5 expression［J］.J Bio1 Chem，2009，284(24):16183－16190.

［7］ Reedijk M，Odorcic S，Chang L，et a1.High－1eve1 coexpression of JAG1 and NOTCH1 is observed in human breast cancer and is associated with poor overa11 surviva1［J］.Cancer Res，2005，65(18):8530－8537.

［8］ Zeng Q，Li S，Chepeha DB，et a1.Crossta1k between tumor and endothe1ia1 ce11s promotes tumor angiogenesis by MAPK activation of Notch signa1ing［J］.Cancer Ce11，2005，8(1):13－23.

［9］ Krebs LT，Shutter JR，Tanigaki K，et a1.Hapo1insufficient 1etha1－ity and formation of arteriovernous ma1formations in Notch pathway mutants［J］.Gene Dev，2004，18:2469－2473.

［10］ Bǖch1er P，Gazdhar A，Schubert M，et a1.The Notch signa1ing pathway is re1ated to neurovascu1ar progression of pancreatic cancer［J］.Ann Surg，2005，242:791－801.

［11］ Xue Y，Gao X，Lindse11 CE，et a1.Embryonic 1etha1ity and vascu1ar defects in mice 1acking the Notch 1igand Jagged1［J］.Hum Mo1 Genet，1999，8(5):723－730.

［12］ Herr F，Schreiner I，Baa1 N，et a1.Expression patterns of Notch receptors and their 1igands Jagged and De1ta in human p1acenta［J］.P1acenta，2011，32:554－563.