黃 興，陸世民，王 欣，陳 辰，王 潔，許 林，任斌輝

0 引 言

肺癌發(fā)病率及病死率位居惡性腫瘤之首［1］。肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是其惡性的標(biāo)志和特征，也是肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因，約90%患者最終死于肺癌轉(zhuǎn)移［2］。當(dāng)前針對肺腺癌驅(qū)動基因表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)治療顯示了較好的臨床療效［3-5］，但肺癌總體5 年生存率依然在20%～30%［6］。因此篩選肺癌侵襲轉(zhuǎn)移特異的新型分子靶標(biāo)并探索其功能，是當(dāng)前肺腺癌研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點問題。包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)，真核細(xì)胞內(nèi)的膜性細(xì)胞器之間的物質(zhì)運輸(如蛋白質(zhì)、脂類)，主要通過囊泡完成;細(xì)胞通過囊泡運輸系統(tǒng)完成生命活動，包括新陳代謝、命運決定、增殖分化、運動遷移及損傷修復(fù)等［7］。有研究報道，N-乙基馬來酰胺-敏感因子受體(soluble NSF attachment protein receptors，SNARE)蛋白作為囊泡運輸系統(tǒng)的核心，在基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)運過程中起到了非常重要的作用，從而促進(jìn)了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［8-9］。而可溶性N-乙基馬來酰胺-敏感因子附著蛋白(synaptosome associated protein，SNAP)作為SNARE 蛋白的一種，主要參與了這一過程。SNAP蛋白家族作為SNARE 復(fù)合物的一大類，目前已知主要有SNAP23、SNAP25、SNAP29 及SNAP47 4 種蛋白，其中SNAP23 及SNAP47 是全身表達(dá)的［10-11］。但目前尚無囊泡運輸系統(tǒng)SNARE 復(fù)合物關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的研究。因此我們認(rèn)為針對非小細(xì)胞肺癌，挖掘肺癌相關(guān)的SNAP，將有助于揭示肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的新機制，為臨床診療提供新思路。

我們前期進(jìn)行了大通量的基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn)SNAP23 是正常肺組織中主要表達(dá)的SNAP 蛋白，而SNAP47 基因在肺癌組織中相對于癌旁組織的表達(dá)明顯升高。通過TCGA 在線數(shù)據(jù)庫(http://cancergenome.nih.gov/)下載相應(yīng)肺腺癌組織及癌旁組織SNAP47 RNA seq 數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表明非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本中SNAP47 mRNA 表達(dá)明顯高于對應(yīng)癌旁組織(P ＜0.01)。因此，本研究應(yīng)用TCGA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步篩選驗證SNAP 在肺癌中的表達(dá)，并檢測臨床肺癌患者癌組織和癌旁組織中相應(yīng)SNAP47 mRNA 的表達(dá)，探討其與臨床病理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步研究SNAP 家族基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集江蘇省腫瘤醫(yī)院2014 年5 月至2014 年9 月共52 例肺腺癌患者資料，其中男29例，女23 例;年齡≥60 歲者29 人。取患者距腫瘤邊緣5 cm 處的正常組織做對照，所有癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理檢查明確診斷。新鮮標(biāo)本取出后立即置于液氮罐內(nèi)凍存，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。病理分期采用肺癌研究國際聯(lián)盟(IASLC)2009 年公布的TNM 分期，患者術(shù)前均未接受過放療或化療?；颊叩男詣e、年齡、有無胸膜侵犯、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、臨床分型分期等臨床資料完整。

1.2 主要試劑和儀器 總RNA 抽提試劑Trizol Reagent 為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品;Real-time 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(R0036A)為Takara 公司產(chǎn)品;SYBR?Select Master Mix 試劑盒和實時定量PCR 檢測儀購自美國Applied Biosystems 公司。

1.3 引物 根據(jù)Genebank 公布的人SNAP23、SNAP25、SNAP29 及SNAP47 基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件primer5.0 設(shè)計引物，并經(jīng)Genebank Blast 檢索確定引物的特異性。內(nèi)源性對照基因選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，GAPDH)。引物序列:SNAP47 上游引物:GCTGTCGCTCAGGTTCAT，下游引物:CTCCCTCCAGAAATGCTC;SNAP23 上游引物:CTGGGTTTAGCCATTGAGTCTCAGG，下游引物:GGTGTCAGCCTTGTCTGTGATTCG;SNAP25 上游引物:ATGGATGAAAACCTAGAGCAGG，下游引物:ACACTTAAC CACTTCCCAGC;SNAP29 上游引物:ATGTCTGGCTATCCTAAA，下游引物:CTGGCTTGGTACTTGTT;GAPDH 上游引物:GAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游引物:GAAGATGGTGATGGGATTTC。所有引物均由上海Invitrogen 公司合成。

1.4 方法

1.4.1 總RNA 提取及濃度測定 使用TRIzol Reagent 一步法提取肺腺癌細(xì)胞株及肺癌組織標(biāo)本總RNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書。隨后經(jīng)紫外分光光度計確定所得到的RNA A260/A280比值在1.8 ～2.0之間，說明RNA 無蛋白污染，符合后續(xù)RT-qPCR實驗要求。最后，通過A260的值計算RNA 的濃度。總RNA 提取后加入100 μL 焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀釋，儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 cDNA 合成 反應(yīng)體系20 μL。取1.5 μg RNA，加入4 μL 5×PrimeScriptTMRT Master Mix，然后加無RNA 酶水至20 μL。反應(yīng)條件:37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃15 min 行逆轉(zhuǎn)錄。合成好的cDNA 置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈(real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)反應(yīng) 反應(yīng)體系10 μL。2×SYBR?Green Real-time PCR Master Mix 5 μL，上游引物(5 μmoL/L)0.4 μL，下游引物(5 μmoL/L)0.4 μL，cDNA 2 μL，加DEPC水至10 μL。將反應(yīng)管置于7300 Real-time PCR 反應(yīng)儀(Applied Biosystem 中)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min 后，按下述條件擴增40 個循環(huán):95 ℃10 s，60 ℃1 min。每個實驗重復(fù)3 次。采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達(dá)量［12］，公式如下:

ΔΔCt=ΔCt-Avg.ΔCt=(CtSNAP47-CtGAPDH)-Avg.

(CtSNAP47-CtGAPDH)

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。腫瘤及瘤旁組織SNAP47 表達(dá)均數(shù)比較采用配對t 檢驗，兩獨立樣本均數(shù)的比較視方差齊性檢驗(以0.1作為檢驗水準(zhǔn)進(jìn)行Levene 檢驗)結(jié)果，當(dāng)方差齊同時，用兩獨立樣本t 檢驗，當(dāng)方差不齊時，用Satterthwaite 校正t 檢驗。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SNAP47 mRNA 在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá) SNAP47 mRNA 在正常肺組織和肺癌組織中都有表達(dá)，且52 例中有41 例(78.9%)的SNAP47 mRNA 表達(dá)水平高于正常組織，其中33 例(63.5%)比正常組織高2 倍以上，20 例(38.5%)比正常組織高4 倍以上，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 肺癌組織中SNAP47 mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析 在低分化與中高分化的患者中，SNAP47 mRNA 表達(dá)的差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.476)。SNAP47 mRNA 的表達(dá)量與患者性別和年齡及胸膜侵犯情況之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。但在不同臨床分期中不同，肺癌Ⅱ、Ⅲ期患者SNAP47 mRNA 的表達(dá)水平顯著高于I 期患者，N1+N2 組患者SNAP47 mRNA 的表達(dá)水平也明顯高于N0 組患者(P ＜0.05)。見表1。

表1 SNAP47 mRNA 表達(dá)與臨床資料相關(guān)性分析Table 1 Correlation between SNAP47 mRNA level and clinicopathologic characteristics

表1 SNAP47 mRNA 表達(dá)與臨床資料相關(guān)性分析Table 1 Correlation between SNAP47 mRNA level and clinicopathologic characteristics

特征 n 表達(dá)比例 P值性別男 29 4.588±4.415 0.611女 23 5.203±4.201年齡(歲)≥60 29 4.886±3.378 0.969＜60 23 4.839±4.978胸膜侵犯有 28 5.368±4.112 0.365無 24 4.267±4.505淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N0 28 3.360±2.987 0.005 N1+N2 24 6.609±4.942分化程度低 13 4.084±4.507 0.476中高 39 5.118±4.245 TNM 分期Ⅰ 23 2.718±2.370 0.001Ⅱ、Ⅲ29 6.558±4.730

3 討 論

尋找并研究肺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，對改善肺癌患者預(yù)后意義重大［13-14］?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)降解細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。SNARE 復(fù)合物(VAMP3，Stx13 及SNAP23)參與基質(zhì)金屬蛋白酶的轉(zhuǎn)運分泌進(jìn)而降解細(xì)胞外基質(zhì)實現(xiàn)纖維肉瘤細(xì)胞(HT-1080)的侵襲轉(zhuǎn)移［9］。而Williams 等［15］在侵襲性乳腺癌細(xì)胞株中證實SNARE 復(fù)合物(VAMP7，Stx4 及SNAP23)介導(dǎo)侵襲偽足形成和膜相關(guān)MT1-MMP 的轉(zhuǎn)運從而影響腫瘤細(xì)胞侵襲。

SNAP 家族作為SNARE 家族的一員，在MMP轉(zhuǎn)運過程中起到了關(guān)鍵的作用，從而參與了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。本組通過前期的芯片發(fā)現(xiàn)SNAP47 基因在肺腺癌中的表達(dá)明顯增高。因此，本研究探討SNAP 家族在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。研究結(jié)果顯示:TCGA 數(shù)據(jù)庫中，SNAP47 在包括肺腺癌在內(nèi)的非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯高于對應(yīng)瘤旁組織，SNAP23 為低表達(dá)，SNAP25 及SNAP29 的表達(dá)無明顯差異。隨后，針對52 對新鮮標(biāo)本組織，應(yīng)用qRT-PCR 方法檢測了SNAP47 mRNA 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):癌組織標(biāo)本中SNAP47 mRNA 的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且SNAP47 mRNA 的表達(dá)與腫瘤的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況有密切的聯(lián)系。SNAP47 mRNA 的表達(dá)在不同TNM 分期有顯著的差異，隨著肺腺癌臨床分期的增高，SNAP47 的表達(dá)也相應(yīng)增高，在Ⅱ、Ⅲ期患者的表達(dá)水平明顯高于I期，根據(jù)此結(jié)果可以推測SNAP47 參與了肺腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程。N1+N2 組患者SNAP47 的表達(dá)水平明顯高于N0 組，表明SNAP47 的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有密切的聯(lián)系，這從另一方面提示SNAP47 參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。由于腫瘤較小，無法進(jìn)行T 分期的分層分析，因此SNAP47 是否與肺癌的T 分期相關(guān)仍需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，SNAP47 的高表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，參與了肺腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)移，有望作為肺癌的預(yù)后和轉(zhuǎn)移指標(biāo)或治療靶點?；谇捌赟NAP 家族蛋白在MMP 轉(zhuǎn)運中的研究，我們推測SNAP47 也可能通過增加MMP 的轉(zhuǎn)運實現(xiàn)肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的體內(nèi)體外實驗有助于明確SNAP47 對于肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用并揭示其可能的機制。

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