陳 朝，黃一摯，伍小燕，黎 奔，陶 文，郭建文

0 引 言

干細胞治療缺血性腦血管病是目前最前沿的研究課題之一，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)可以直接誘導(dǎo)為神經(jīng)干細胞，然后再轉(zhuǎn)化為具有各種功能的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞，替代由于缺血缺氧壞死的神經(jīng)細胞，促進神經(jīng)功能的修復(fù)［1］。但當腦組織缺血缺氧時，組織內(nèi)興奮性氨基酸、氧自由基、黏附分子、炎癥因子分泌增多等因素，導(dǎo)致新移植的BMSCs 在缺血組織存活率和分化率較低，致使其治療效果受到限制［2－3］。因此，尋找一種有效的促進BMSCs 增殖、提高BMSCs 存活率的方法成為當前研究的熱點［4－5］。調(diào)節(jié)腦中血海的中藥復(fù)方腦脈1 號(NMYH)在臨床上已被證實是治療缺血中風(fēng)一有效方劑［6］，不僅能改善腦組織微循環(huán)，還可抑制炎癥反應(yīng)，促進機體形成有利于移植細胞存活的微環(huán)境。本研究將BMSCs 移植于大腦中動脈栓塞模型大鼠，同時給予NMYH，探討其對移植BMSCs 存活的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠，3 ～4 月齡，60 只，雄性，體重250 ～330 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物的合格證號:0051720。所有大鼠置于清潔級動物房內(nèi)飼養(yǎng)，光照明暗各12 h，溫度20 ℃～25 ℃，濕度45%～55%。

1.2 主要試劑與儀器 NMYH 膠囊(由炙天麻、水蛭、黃芪、制南星、半夏、川芎、益母草組成，廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供，批號090702)，氯甲基苯甲酰氨(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine，CM-Dil)(美國Molecular Probes 公司，批號V22888)，兔抗大鼠CD34 抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號BS-0646R)，SABC 試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為SP-9001、ZLI-9032)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific 公司)，腦立體定位儀(美國STOELTING公司)，熒光顯微鏡(瑞士Leica 公司)，Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件(美國Media Cybernetics 公司，型號41M60032-00032)。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMSCs 的培養(yǎng)、鑒定及標記 參照文獻［7］中的方法進行BMSCs 培養(yǎng)，鑒定及CM-Dil 標記。

1.3.2 大腦中動脈栓塞模型的建立 參照Zea Longa 方法［8］并加以改進。行大腦中動脈栓塞后2 h，拔出栓線長度3 ～4 mm，形成再灌注。模型成功的標志為栓塞對側(cè)肢體偏癱，行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。

1.3.3 分組與用藥 手術(shù)后按隨機區(qū)組法將大鼠分為4 組，即模型組、BMSCs 組、NMYH 組、BMSCs+NMYH 組，每組根據(jù)取材時間點又分為7、14、21 d組，每組每個時間點均為5 只大鼠。

缺血再灌注24 h 后，BMSCs+NMYH 組大鼠右側(cè)紋狀體區(qū)(AP=0 mm，MR=2.0 mm，DV=4.5 mm)通過立體定向儀注射10 μL(5×104/mL)細胞懸液，給予NMYH 1.5 g/kg 灌胃(按動物系數(shù)折算，相當于70 kg 成人臨床劑量的3 倍)，1 次/d;BMSCs 組注射等量細胞懸液，等滲鹽水灌胃;NMYH 組注射等體積無血清L-DMEM，NMYH 灌胃;模型組注射等體積無血清L-DMEM，等滲鹽水灌胃。每周根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃藥物的用量和灌胃體積，直至取材。

1.3.4 取材 各組分別于移植后第7、14、21 天灌注取腦，置于4%多聚甲醛中固定24 h。選取前囟后2 mm 的腦組織，轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液中脫水至腦組織下沉，待作冰凍切片檢查移植細胞存活情況。其余組織繼續(xù)置于4%多聚甲醛中，待作石蠟切片用于CD34 免疫組化。

1.4 觀察指標

1.4.1 移植細胞在腦內(nèi)存活情況 取出腦組織，仔細辨認針道位置，去除額極部分，以O(shè)CT 包埋，－20 ℃預(yù)凍15 min。在距離硬腦膜4.5 mm 處，垂直于進針方向作水平橫斷面的連續(xù)冰凍切片，厚度為20 μm，連切5 片。在熒光顯微鏡下觀察、拍照，于Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)中自動測定不同時間點供體細胞所占積分吸光度［9］。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法檢測CD34表達 標本切片常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)微波加熱修復(fù)，3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，正常山羊血清封閉15 min 后滴加一抗(1∶50 的兔抗大鼠CD34)，4 ℃過夜，經(jīng)冷PBS 洗2 次后滴加生物素標記的羊抗兔IgG，室溫孵育60 min 后滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。高倍鏡下(×400 倍)在紋狀體區(qū)隨機各取5 個視野計數(shù)陽性細胞。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗，采用多因素方差分析方法分析。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 移植細胞在腦內(nèi)存活情況 BMSCs 組和BMSCs+NMYH 組的BMSCs 移植后第7 天，CM-Dil陽性細胞主要位于針道附近，發(fā)出明亮的紅色熒光，多為梭形。移植后第14 天，移植細胞進一步向周圍遷移，且趨向于缺血周邊區(qū)，梭形細胞減少，橢圓形或不規(guī)則細胞增多。移植后第21 天，CM-Dil 陽性細胞逐漸減少，但熒光依然清晰明亮，主要呈橢圓形或不規(guī)則形，見圖1。BMSCs 組和BMSCs+NMYH組BMSCs 移植后不同時間點熒光吸光度見表1。與BMSCs 組比較，BMSCs+NMYH 組的熒光吸光度在第14、21 天時均顯著增加(P ＜0.05)。

2.2 CD34 表達結(jié)果 BMSCs 移植、NMYH 和時間點對CD34 表達的效應(yīng)均有顯著性意義(FBMSCs=63.280，P=0.000;FNMYH=86.260，P=0.000;F時間=11.069，P=0.000)，NMYH 與BMSCs 移植的交互作用有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.258，P=0.000);與模型組比較，其余各治療組在各時間點CD34 的表達均顯著增加(P ＜0.01);與BMSCs 組同時間點比較，NMYH 組在各時間點CD34 的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，而BMSCs+NMYH 組在各時間點CD34 的表達均顯著增加(P ＜0.05)。見表1，圖2。

圖1 CM-Dil 標記的BMSCs 的立體定向移植后腦內(nèi)示蹤(×100)Figure 1 Tracing in brain of BMSCs labeled by CM-Dil after stereotactic imlantion(×100)

表1 各組大鼠BMSCs 熒光吸光度和CD34 陽性細胞數(shù)，n=5)Table 1 Fluorescent integral absorbance of BMSCs and Numbers of CD34 positive cells of rats in different groups，n=5)

表1 各組大鼠BMSCs 熒光吸光度和CD34 陽性細胞數(shù)，n=5)Table 1 Fluorescent integral absorbance of BMSCs and Numbers of CD34 positive cells of rats in different groups，n=5)

與BMSCs 組同時間點比較，*P ＜0.05;與模型組同時間點比較，#P ＜0.01;與BMSCs 組同時間點比較，△P ＜0.05

組別 熒光吸光度(×106，A)CD34 陽性細胞(個)模型組第7 天 － 15.20±2.77第14 天 － 19.20±3.11第21 天 － 14.20±2.17 BMSCs 組第7 天 2.15±0.15 23.40±2.07#第14 天 1.23±0.17 27.40±3.44#第21 天 0.23±0.09 23.80±2.49#NMYH 組第7 天 － 24.80±2.39#第14 天 － 27.80±3.96#第21 天 － 25.20±3.70#BMSCs+NMYH 組第7 天 2.40±0.25 27.40±3.21#△第14 天 1.61±0.25* 33.20±4.02#△第21 天 0.36±0.09* 29.40±3.05#△

圖2 第21 天大鼠腦組織CD34 表達(SABC 染色 ×400)Figure 2 Expression of CD34 in brain of rats in different groups at the 21th day(SABC staining ×400)

3 討 論

細胞移植后的細胞存活數(shù)量與治療效果密切相關(guān)，而移植細胞要面對的是受損器官和組織由于缺血、炎癥反應(yīng)和促凋亡因子等因素所形成的惡劣微環(huán)境。目前提高細胞存活的方法主要有以下3 種:①對宿主組織進行干預(yù)，從而更好地接受移植細胞。②對移植細胞進行體外預(yù)適應(yīng)。③基因修飾移植細胞［10］。近幾年來中醫(yī)藥通過對宿主的干預(yù)，研究是否影響B(tài)MSCs 在宿主體內(nèi)的存活已取得一定進展。已發(fā)現(xiàn)黃芪皂甙Ⅳ［11］、芒果苷［12］和薯蕷皂甙［13］通過抑制凋亡基因蛋白酶活性對BMSCs 缺氧損傷誘發(fā)的凋亡具有保護作用;大黃苷元通過降低炎性因子的表達和減低血腦屏障的通透性［14］，形成有利于移植細胞存活的微環(huán)境。中藥復(fù)方NMYH 由制天麻、水蛭、黃芪、制天南星、半夏、川芎、益母草等7 味藥組成，以黃芪益氣，充盈血海為君藥;制南星、半夏、天麻化痰通絡(luò)為臣藥;川芎、水蛭、益母草破血活血利水以通調(diào)脈道為佐使。諸藥共奏調(diào)節(jié)腦中血海之功效。大樣本、前瞻性、多中心、隨機對照臨床研究證明，該制劑治療急性缺血中風(fēng)病安全有效，可顯著降低患者的病死率和致殘率［6］。方中黃芪、川芎、制南星、水蛭等中藥及其有效成分可抑制炎癥反應(yīng)［15］，減少細胞凋亡［16］，清除氧自由基，改善微循環(huán)［17］。因此NMYH 與BMSCs 移植聯(lián)合應(yīng)用，可改善移植細胞生存的微環(huán)境，促使更多的移植細胞存活下來。本研究結(jié)果顯示，CM-Dil 標記的BMSCs 腦內(nèi)定向移植后，隨著時間的延長，熒光吸光度顯著減少，BMSCs 移植聯(lián)合使用NMYH 可顯著增加CM-Dil熒光吸光度，提示BMSCs+NMYH 組BMCSs 存活數(shù)量較單獨移植組顯著增多。

促進功能性血管生成是腦缺血損傷后恢復(fù)腦血流、改善功能恢復(fù)的關(guān)鍵。目前已發(fā)現(xiàn)很多中藥復(fù)方和有效成分能通過上調(diào)相關(guān)細胞因子如VEGF、bFGF 等的表達，進而促進內(nèi)皮細胞的增生，新生血管形成［18－19］。本研究前期研究表明［20－21］，NMYH可促進BMSCs 移植治療大鼠缺血再灌注損傷的作用，保護神經(jīng)元，促進缺血區(qū)血管生成。CD34 為相對分子質(zhì)量105 000 ～120 000 的跨膜細胞表面糖蛋白，可在血管內(nèi)皮細胞及其它組織中表達，具有黏附、加速血管前內(nèi)皮細胞聚集形成血管以及調(diào)控造血細胞增殖和分化的功能。由于其在新生血管內(nèi)皮中表達遠大于非新生血管內(nèi)皮［22］，因此本研究采用CD34 作為腦缺血部位血管新生的效應(yīng)指標。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，BMSCs 組、NMYH 組可顯著增加CD34 表達，且BMSCs 移植和NMYH 聯(lián)合使用存在交互效應(yīng)，表明NMYH 中藥復(fù)方可促進腦缺血損傷后微血管再生，而NMYH 可提高BMSCs移植后的微血管再生作用，從而能增加移植細胞區(qū)域的血供，促進BMSCs 移植后的存活。但由于中藥復(fù)方制劑NMYH 膠囊化學(xué)成分較多，可具有較多的作用靶點。研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細胞衍生因子1 除參與趨化干細胞定向遷移途徑，還可能通過增強E2F6基因，負性調(diào)控E2F1 基因抑制缺血缺氧導(dǎo)致的BMSCs 凋亡［23］。范慧慧等［24］根據(jù)中醫(yī)“生新”等理論認為活血化瘀中藥通過調(diào)控BMSCs 旁分泌可促進血管再生。因此，本研究將在調(diào)控BMSCs 旁分泌通路、基質(zhì)細胞衍生因子1 基因表達等方面進一步研究NMYH 與BMSCs 移植的聯(lián)合效應(yīng)，闡明調(diào)節(jié)腦中血海法作用的靶點和機制，為中醫(yī)藥輔助干細胞技術(shù)治療腦梗死提供新的思路和方法。

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