張容亮，韋 嘉，陸永萍，袁 媛，湯躍躍，李云燕

0 引 言

非酒精性脂肪肝病發(fā)病率近幾年在中國和歐美迅速上升，成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病［1－5］。調(diào)控動物模型的食物構(gòu)成及攝入是研究相關(guān)脂肪肝發(fā)病的最好方法，高脂飲食可影響肝脂肪代謝，使肝三酰甘油合成及輸出增多，更快建立兔脂肪肝模型。本研究首先對兔進行高脂喂養(yǎng)，建立與人類脂肪性肝病發(fā)生發(fā)展相似的脂肪肝動物模型，用二維超聲及病理切片觀察兔脂肪肝纖維化情況，為深入研究肝纖維化發(fā)病機制及病理提供實驗?zāi)Ｐ?。脂肪肝是以肝?xì)胞彌漫性脂肪變性為主的臨床病理綜合征。由于脂肪肝具有固定的超聲圖像特征，大多數(shù)學(xué)者肯定了超聲檢查作為脂肪肝首選的影像學(xué)診斷手段，且簡便、無創(chuàng)、好操作，能實時動態(tài)追蹤監(jiān)測兔肝回聲，動態(tài)存儲圖片以便分析［3－6］。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 健康雄性日本大耳白兔40只，體重1.00 ～1.52 kg，按隨機數(shù)字表法分為對照組和實驗組，每組20 只，實驗動物許可證號:SCXK(滇)2011-0004，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物科提供，實驗組給予高脂喂養(yǎng)(配方為:膽固醇2%，牛油10%，白糖5%，蛋黃粉8%，基礎(chǔ)飼料75%)，自由飲水，通風(fēng)，12 h 光照［7］。對照組:給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，通風(fēng)，12 h 光照。

1.2 超聲觀察兔肝 采用Aixplorer 型ShearWaveTM實時剪切波超聲成像診斷儀(法國Supersonic Imagine公司)，L15-4 探頭。模型制備過程中喂養(yǎng)12、16 和20 周，每次超聲觀察前兔禁食8 ～12 h，將兔平躺固定于操作臺上(無需麻醉)，備皮，充分暴露檢查區(qū)，共對兔肝進行4 次超聲觀察，包括肝大小、回聲、包膜情況，有無腹水等，對肝聲像圖征象進行詳細(xì)記錄。超聲評價脂肪肝程度，輕度:肝體積稍增大，光點細(xì)密、回聲輕度增強，肝內(nèi)管狀結(jié)構(gòu)可見;中度:肝體積增大，光點細(xì)密、回聲增強，遠(yuǎn)場回聲衰減，管狀結(jié)構(gòu)模糊;重度:肝體積增大，光點細(xì)密、回聲顯著增強，遠(yuǎn)場回聲顯著衰減，管狀結(jié)構(gòu)顯示不清［8－9］。

1.3 病理觀察 20 周超聲觀察后處死動物，觀察肝大小、形態(tài)、顏色、表面光滑度、葉間裂寬度、邊緣銳利度及切面情況。10%甲醛固定肝組織標(biāo)本，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片(片厚4 ～6 μm)，分別進行HE及苦味酸(天狼星紅:10%的中性甲醛溶液、硝基染料類)染色。根據(jù)脂肪肝的病變程度分為5 度(F0-4)，F(xiàn)0:正常肝，脂肪變面積＜5%;F1:輕微脂肪變性，脂肪變面積10%～30%;F2:輕度脂肪肝，脂肪變面積31%～50%;F3:中度脂肪肝，脂肪變面積51%～75%;F4:重度脂肪肝，＞75%肝細(xì)胞脂肪變性。根據(jù)膠原纖維沉積部位、范圍、對肝結(jié)構(gòu)破壞程度和對肝微循環(huán)的影響的大小，將肝纖維化分為4 期;S1:匯管區(qū)和匯管區(qū)周圍纖維化及局限竇周纖維化或小葉內(nèi)小纖維瘢痕，以上纖維化形式范圍小，不足以影響小葉結(jié)構(gòu)的完整性或微循環(huán);S2:小葉內(nèi)有纖維間隔形成，可見多條纖維間隔，但小葉結(jié)構(gòu)大致保留;S3:大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，致小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但尚無肝硬化。S4:纖維間隔包繞于假小葉周圍，間隔內(nèi)膠原及彈力纖維經(jīng)改建，多環(huán)繞假小葉成平行排列［9－10］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用t 檢驗，兔齡與體重的關(guān)系采用Pearson線性相關(guān)分析。以P≤0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

動物模型在制備飼養(yǎng)過程中，對照組死亡2 只，于第12 及16 周死亡，死亡原因為不適應(yīng)環(huán)境;實驗組因于第12 周死亡1 只，原因可能為對高脂肪飼料不耐受，腹瀉致死。

2.1 一般情況 對照組:兔皮毛光滑，活動靈活，進食量與排便正常，體重穩(wěn)步逐增。實驗組:兔皮毛光滑，活動稍遲緩，進食量大，排便正常，體重增長快。喂養(yǎng)12、16、20 周實驗組體重均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。2 組兔齡與體重均呈正相關(guān)(r=0.96，P ＜0.01)。見表1。

2.2 兔肝超聲觀察 對照組:全部監(jiān)測過程中，兔肝二維超聲表現(xiàn)呈中等稍低回聲，內(nèi)部回聲均勻，光點稍粗，管道結(jié)構(gòu)清晰，管壁與實質(zhì)對比回聲稍強，包膜規(guī)則、光滑，無腹水。實驗組:喂養(yǎng)0 周，兔肝超聲表現(xiàn)同對照組;喂養(yǎng)12 周后均發(fā)生了脂肪肝改變，且隨著喂飼期的增加，脂肪肝的超聲表現(xiàn)逐漸加重。12周時，8 例表現(xiàn)為輕度脂肪肝聲像，與對照組對比，兔肝光點稍顯細(xì)密，回聲稍增強，肝體積略增大;9 例為中度脂肪肝，兔肝光點細(xì)密，回聲增強，肝體積增大較輕度組明顯;2 例為重度，光點細(xì)密，回聲增強，肝體積增大更明顯，肝內(nèi)管道系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模糊;16 周時，5 例輕度脂肪肝發(fā)展為中度，2 例中度脂肪肝發(fā)展為重度;20 周時，3 例輕度脂肪肝全部發(fā)展為中度脂肪肝，5 例中度脂肪肝發(fā)展為重度脂肪肝。16 周及20 周時均有3 例重度脂肪肝兔發(fā)生了腹水聲像(肝腎間隙可見暗區(qū)1 ～3 cm)，進入了肝硬化期。見圖1。喂養(yǎng)20周后，對全部37 例兔肝均進行超聲觀察后，取出兔肝，觀察兔肝標(biāo)本，制備病理切片。對照組:肝被膜光滑，大小適中，肝外觀呈暗紅色，左葉明顯大于右葉，葉間裂清晰，邊緣銳，切面光滑;如觸口唇，彈性好，質(zhì)軟細(xì)膩。實驗組:肝均勻腫大，肝葉飽滿，右葉增大，肝左右葉比例減小，葉間裂變小，肝邊緣變鈍，顏色為灰紅色，質(zhì)地韌，如觸鼻尖，有油膩感。

表1 不同時間生長狀況兔齡肝超聲表現(xiàn)比較Table 1 Comparison of rabbit's weight(kg)in two groups and the grade of fatty liver in sonogram

圖1 兔肝超聲圖像Figure 1 The sonographic image of liver in two groups

2.3 HE 染色病理切片觀察脂肪變的情況 對照組:以小葉中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉輪廓清晰，肝細(xì)胞呈多邊形，細(xì)胞分界清，核圓，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)豐富，呈嗜堿性。脂肪變面積＜5%。以F0 期為主。實驗組:肝細(xì)胞排列紊亂不齊，肝細(xì)胞濁腫，部分肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中可見大小不等圓形脂滴空泡肝細(xì)胞，脂肪變性廣泛分布，有炎性細(xì)胞浸潤。脂肪變面積35%～85%。脂肪變程度以中重度(F3－F4)為主。見圖2，表2。

圖2 鏡下觀察兔肝病理圖片(HE ×200)Figure 2 The pathological result of livers in two groups(HE staining ×200)

2.4 苦味酸-天狼星紅染色病理切片分析纖維化程度 對所有兔肝進行苦味酸染色，對照組:未見明顯的纖維化，均為S0 期;實驗組:出現(xiàn)不同程度的纖維化表現(xiàn)，以中重度纖維化為主(S2 期以上)。見圖3，表3。

表2 兔肝HE 染色脂肪變分期比較(n)Table 2 The pathological staging of steatosis(HE staining)in two groups(n)

圖3 鏡下觀察兔肝纖維化程度(苦味酸染色 ×200)Figure 3 The pathological result of livers in two groups(Picric-Sirius Red staining ×200)

表3 實驗兔20 周肝超聲與病理分期對照(n)Table 3 Comparison of ultrasonography and pathological staging(n)

3 討 論

隨著對脂肪肝機制的深入認(rèn)識，動物模型的建立也成為了關(guān)鍵，制備完善、標(biāo)準(zhǔn)的動物模型是研究疾病的基礎(chǔ)，通過高脂飼養(yǎng)建立的兔肝纖維化模型與人類日常飲食所致的肝脂肪代謝相似，是較理想的肝纖維化兔模型［8－12］。

本實驗選用日本大耳兔造模，是因為兔的飲食結(jié)構(gòu)利用造模，兔肝體積更便于超聲觀察。本研究給予兔高脂飲食后，發(fā)現(xiàn)兔脂肪肝在12 周后陸續(xù)形成，至16 ～20 周后基本全部形成了中重度脂肪肝，最終經(jīng)過病理也證實了脂肪肝兔模型成功建立。高脂飲食的造模方法脂肪攝入量易控制，影響因素少，可控性強，重復(fù)性好，成功率高。

我們利用超聲對2 組兔肝進行持續(xù)監(jiān)測，在完全相同的檢查條件下，對同一兔不同喂養(yǎng)時期的肝進行觀察。對照組不同時期(4 次)肝超聲表現(xiàn)基本相同;而實驗組12 周時便有脂肪肝的發(fā)生，隨著喂養(yǎng)周期的增長，脂肪肝的程度逐漸加重，進入16 ～20周時以重度脂肪肝為主，并有部分發(fā)生了肝硬化腹水。超聲可動態(tài)觀察此過程，并且明確本方法造模的可行性。20 周時，經(jīng)過超聲觀察后，對兔肝進行病理觀察，病理與超聲表現(xiàn)呈一致趨勢。此結(jié)果即顯示了脂肪肝分度的病理特征，同時也證實了超聲觀察的可靠性。

高脂所致的脂肪變多以大泡性為主的混合性脂肪變，大泡性肝脂肪變多呈良性過程，去除病因可逆轉(zhuǎn)，小泡性脂肪肝變則預(yù)后不良，不經(jīng)治療兩者均可引起壞死性炎癥及肝纖維化。此次造模過程中，有2 例在12 周時呈現(xiàn)重度脂肪肝聲像的兔肝20 周末的肝纖維化分期均為S4 期，并有肝硬化腹水的表現(xiàn)，這與脂肪肝程度越重、時間越久、肝纖維化就越重的病理原理相一致。本研究模擬目前人類不良飲食方式，采用喂飼高脂方法建立脂肪肝動物模型，探討脂肪肝的病變特點和病理學(xué)量化診斷指標(biāo)。一般認(rèn)為，脂肪肝的發(fā)展是從單純性脂肪肝到脂肪性肝炎，最終進展為脂肪性肝硬化［10－12］。

本研究病理觀察顯示:所有經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)的兔模型，均形成了脂肪肝，并且進入了纖維化期，與超聲的觀察結(jié)果一致，提示在建模過程中，超聲是一種可靠、可實施動態(tài)觀察的手段。超聲檢查對本模型建立提供了一個值得探討的觀測指標(biāo)，簡便、無創(chuàng)、操作便利，無需麻醉動物，能實時動態(tài)追蹤監(jiān)測，且能動態(tài)存儲圖片以便分析。但本實驗局限性在于例數(shù)尚不夠，還需進一步擴大標(biāo)本量加以研究;此外，我們選用兔制備動物模型，兔為食草動物，常規(guī)飲食不同于人類，其消化代謝與人類有一定的差異，尚不能完全替代人脂肪肝的形成演變［13－16］。

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