樊建勇，王 穎，楊慧蘭，梁 潔，李翠華

0 引 言

生殖器皰疹易復(fù)發(fā)，尚無徹底治愈的方法。研發(fā)有效的生殖器皰疹病毒疫苗是預(yù)防和治療單純皰疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus Ⅱ，HSV-2)感染的關(guān)鍵。在HSV-2 編碼的糖蛋白中，gD 在病毒復(fù)制和刺激中和抗體的產(chǎn)生中起重要作用，也是宿主細胞免疫和體液免疫反應(yīng)的主要靶標之一［1］，是目前疫苗研究的重要靶點。本課題組也先后構(gòu)建了HSV-2 gD 疫苗、HSV-2 gD-HSP 等多種蛋白、核酸疫苗，并在細胞水平及動物實驗中研究了其免疫效應(yīng)［2－4］，但這些疫苗誘發(fā)的細胞免疫水平低，盡管給予適當修飾后疫苗誘發(fā)的細胞免疫效應(yīng)有所增強，但仍不能達到臨床治療HSV 感染的要求。樹突狀細胞(dendritic cell，DC)疫苗可誘發(fā)強大的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)效應(yīng)，而且不存在基因整合等潛在危險，是抗腫瘤、病毒感染性疾病的理想工具。本研究制備了腺病毒介導(dǎo)的HSV-2 gD 基因修飾的樹突狀細胞(pAdeno-HSV-2 gD-DC)疫苗，為其下一步抗病毒研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶及Taq DNA 聚合酶均購自TaKaRa 公司，質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Miniprep Kit 購 自O(shè)mega Bio-Tok 公 司，TRIZOL購自北京鼎國生物工程公司，cDNA 合成試劑盒OmniscriptTMReverse Transcriptase 購自QIAGEN公司，即用型SABC 免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德公司，1640 培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Hyclone 公司，山羊抗gD 多抗購自SANTA CRUZ 產(chǎn)品，兔抗山羊HRP-IgG 購自威佳公司，病毒DNA 提取試劑盒(Minibest viral RNA/DNA extraction kit)購自TaKaRa 公司。重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF)、重組小鼠白細胞介素-4(recombinant murine interleukin-4，rmIL-4)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)購自prospec 公司，F(xiàn)ITC 標記的抗小鼠CD40、CD80、CD86 單抗購自美國eBioscience 公司，6 ～8 周雌性BALB/C 小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物合格證號:scxk 粵2011-0015，所有小鼠置于溫度(22±2)℃、相對濕度為40%～70%，12 h 明暗交替環(huán)境中。實驗期間自由進食、飲水，喂以標準顆粒飼料，標準喂養(yǎng)籠。HSV-2 333 株由本實驗室保存。

1.2 gD 基因的擴增及含HSV-2 gD 基因重組腺病毒載體的構(gòu)建 HSV-2 333 株病毒DNA 的提取根據(jù)病毒DNA 提取試劑盒(Minibest viral RNA/DNA extraction kit)說明操作，以此為模板，以HSV-2 gD上游引物:5'CTAGCTAGCATGGGGCGTTTGACCTCCGG 3'及HSV-2 gD 下游引物:5'GCTCTAGACTAGTAAAACAATGGCTGGTGCGAGG 3'為引物(下劃線部分分別為NheⅠ和XbaⅠ酶切位點)，擴增目的基因。本實驗采用Adeno-X 載體系統(tǒng)(BD Biosciences 公司)，該系統(tǒng)主要由Adeno-X viral DNA(腺病毒DNA)、PI-SceⅠ和I-CeuⅠ內(nèi)切酶及pShuttle2 Vector(穿梭質(zhì)粒)組成。PCR 產(chǎn)物以NheⅠ和XbaⅠ雙酶切后，回收片段連入穿梭質(zhì)粒載體Shuttle2 的多克隆位點上，構(gòu)建含gD 基因的穿梭質(zhì)粒載體Shuttle2 gD，雙酶切鑒定。用限制性內(nèi)切酶PI-SceⅠ和I-CeuⅠ酶切Shuttle2 gD，切下含目的基因的表達框與Adeno-X viral DNA(經(jīng)PI-SceⅠ和I-CeuⅠ酶切)連接，挑取陽性克隆，再以PI-SceⅠ和I-CeuⅠ進行測序鑒定。酶切產(chǎn)物以含溴化乙錠(EB)的1%瓊脂糖凝膠電泳分離，UVP 凝膠成像系統(tǒng)成像，測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3 含gD 基因腺病毒包裝、擴增、滴度測定 接種293 包裝細胞于6 孔板中，37 ℃培養(yǎng)12 ～24 h，pAdeno-gD DNA 用PacⅠ酶切線性化后用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293 細胞。培養(yǎng)10 d 后，出現(xiàn)細胞病理性變化，收集細胞，反復(fù)凍融獲得重組腺病毒。收集產(chǎn)生重組腺病毒，將其溶于0.01%PBS 中，于－70℃和37℃之間將細胞凍融3 次，以離心半徑12.5 cm、15 000 r/min離心15 min，收集上清，將上清及pAdeno-HSV-2 gD重組腺病毒繼續(xù)感染包裝細胞擴增病毒，收集并濃縮病毒上清，接種293 于96 孔板中，24 h 后用空斑檢測法行病毒上清滴度測定。

1.4 小鼠DC 分離和體外培養(yǎng)及重組腺病毒的感染 取健康6 ～8 周雌性BALB/C 小鼠股骨和脛骨，無血清1640 培養(yǎng)基沖洗骨髓，將收集到的骨髓沖洗物轉(zhuǎn)入離心管，以離心半徑12.5 cm、1200 r/min 離心10 min，棄去上清，加入3 mLTris-NH4CL 靜置2 min，破除紅細胞，以1200 r/min 離心10 min，棄去上清，補加新的完全培養(yǎng)基含有500 ng/L rmGM-CSF和200 ng/L rmIL-4，隔日半量換液，每次輕振培養(yǎng)板，吸去未貼壁細胞，并在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)和數(shù)量的變化。第5 天起加入誘導(dǎo)成熟因子TNF-α(10 ng/mL)培養(yǎng)2 d。同時，收集培養(yǎng)到第5 天的DC，PBS 液洗2 次，細胞計數(shù)，按1×106/孔加于24孔培養(yǎng)板上，每孔體積為500 μL。加入100 MOI 重組腺病毒pAdeno-HSV-2 gD，置37 ℃，5% CO2孵箱中，培養(yǎng)120 min 后洗去上清，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，用0.05%胰酶消化，重懸細胞，制成單細胞懸液，并計數(shù)。用PBS 洗滌細胞2次(離心半徑12.5 cm，800 r/min 離心5 min)，用培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×107/mL 細胞。加入2 μL的抗體(CD40、CD80、CD86)(1∶50)混勻。室溫、避光、反應(yīng)30 min，PBS 洗滌細胞2 次(離心半徑12.5 cm，800 r/min 離心5 min)，進行流式細胞儀檢測。

1.5 目的基因HSV-2 gD 在pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗中表達的RT-PCR 檢測 轉(zhuǎn)染DC 細胞培養(yǎng)48 h時，加入Trizol，使其充分裂解，提取總RNA 做為模板，參照Qiagen 試劑盒說明，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進行PCR 擴增。設(shè)計的引物:上游引物5'CGGGATCCAGCATGgcctgccgcaGCGTGCTCCTACAT，下游引物5'CGGAATTCGGCCGAGTCC TCGGGGTCTT。

1.6 目的基因HSV-2 gD 在pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗中表達的免疫組化檢測 將長滿細胞的蓋片取出后，用甲醇∶丙酮(1∶1)固定10 ～30 min。將蓋片放在3%過氧化氫甲醇溶液中10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。每張蓋片上加50 μL 的第一抗體，孵育60 min。PBS 洗后每張蓋片上加50 μL 的HRP標記的二抗，溫育10 min。PBS 洗后每張蓋片上加100 μL 新鮮配制的DAB-H2O2溶液，顯微鏡下觀察。

1.7 目的基因HSV-2 gD 在pAdeno-HSV-2 gD-DC疫苗中表達的SDS-PAGE 和Western blot 檢測 細胞消化后離心，棄上清。沉淀細胞用冰冷的PBS 重懸，離心半徑12.5 cm、4000 r/min 離心10 min，重復(fù)3 次，棄上清，加入300 μL 細胞裂解液，充分混合，28 ℃作用30 min。懸液與等體積SDS-PAGE 上樣緩沖液混合，SDS-PAGE 電泳。細胞裂解產(chǎn)物經(jīng)電泳并轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，一抗為羊抗HSV-2 gD 蛋白抗體，二抗為HRP 標記的抗羊IgG 抗體，DAB 顯色，陰性對照為空載體轉(zhuǎn)染DC 細胞的裂解產(chǎn)物。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0 軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料以均數(shù)±標準差)表示，采用單因素方差分析比較，組間兩兩比較用LSD 法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HSV-2 gD 基因的克隆及含HSV-2 gD 基因重組腺病毒載體的構(gòu)建 以HSV-2 病毒DNA 為模板，采用gD 基因引物擴增出相應(yīng)的目的片段。瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR 產(chǎn)物gD 基因同預(yù)期的大小一致(1182 bp)，見圖1。重組質(zhì)粒酶切的結(jié)果顯示:在相應(yīng)的位置可見目的條帶gD(1182 bp)，見圖2。測序結(jié)果與已知序列進行BLAST 同源性達到99%，其中一個堿基發(fā)生無義突變，突變后仍為亮氨酸(CTC 突變成CTA 但仍編碼亮氨酸)。

圖1 PCR 產(chǎn)物擴增結(jié)果Figure 1 The result of amplified gD by PCR

圖2 重組載體酶切結(jié)果Figure 2 The restrictive endonuclease digestion analysis of recombinant vector

2.2 含gD 基因腺病毒滴度測定 pAdeno-gD DNA用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293 細胞10 d 后，出現(xiàn)細胞病理性變化，反復(fù)凍融獲得重組腺病毒，命名為pAdeno-HSV-2 gD 重組腺病毒。收集并濃縮病毒上清，接種293 于96 孔板中，24 h 后用空斑檢測法行病毒上清滴度測定，測得該樣品的病毒活性為4×1010IU/mL。

2.3 小鼠DC 分離、體外培養(yǎng)、鑒定及重組腺病毒的感染 小鼠骨髓來源的單核細胞培養(yǎng)3 ～4 h 貼壁，經(jīng)rmGM-CSF、rmIL-4 誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下可見部分細胞懸浮生長，72 h 后出現(xiàn)細胞集落，細胞數(shù)目增多，貼壁細胞逐漸減少，可見少量具有樹突樣突起的懸浮細胞。5 d 時可見樹突樣懸浮細胞逐漸增多，第5 天起加入誘導(dǎo)成熟因子TNF-α(10 ng/mL)培養(yǎng)2 d，即可誘導(dǎo)出成熟的樹突狀細胞，倒置顯微鏡下可見懸浮細胞大量聚集，表面突起伸長，獲得成熟DC，見圖3。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:成熟DC(d7)和腺病毒感染后DC(pAdeno-HSV-2 gD-DC)比不成熟DC(d5)的表面標志CD40、CD80、CD86 表達明顯升高(P ＜0.01)，pAdeno-HSV-2 gD-DC 與細胞因子刺激誘導(dǎo)成熟的DC 細胞表面分子表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

圖3 倒置顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)時間DC 形態(tài)Figure 3 Morphological characteristic of DC in different phages

表1 流式細胞儀檢測DC 表面分子的表達，%)Table 1 FACS analysis of DC associated surface antigen expression，%)

表1 流式細胞儀檢測DC 表面分子的表達，%)Table 1 FACS analysis of DC associated surface antigen expression，%)

與培養(yǎng)5 d 比較，*P ＜0.01

類型 n 5 D d C 表面分子表7達 d 重組腺病毒刺激的DC CCC DDD488 006 333 975...752±±±011...521 777 436...291±±±345...915*** 888 103...347±±±323...199***

2.4 轉(zhuǎn)染細胞的RT-PCR 檢測 以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板用設(shè)計的引物進行PCR 擴增。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示:pAdeno-HSV-2 gD-DC 出現(xiàn)約630 bp(僅為gD 部分片段)的目的條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC 未出現(xiàn)目的條帶，證實重組質(zhì)粒組gD 可以在DC 細胞表達。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染DC 的RT-PCR 分析Figure 4 The RT-PCR analysis of transferred cells

圖5 顯微鏡下觀察pAdeno-HSV-2 gD-DC 細胞和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC 細胞形態(tài)(IHC ×100)Figure 5 The immunochistochemistry analysis of transferred cells(IHC ×100)

2.5 轉(zhuǎn)染細胞的免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示:pAdeno-HSV-2 gD-DC 細胞細胞質(zhì)呈陽性(棕色);空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DC 細胞呈陰性(藍色)。結(jié)果表明pAdeno-HSV-2 gD-DC 可以表達gD 蛋白。見圖5。

2.6 轉(zhuǎn)染細胞的SDS-PAGE 和Western blot 細胞裂解產(chǎn)物SDS-PAGE 結(jié)果顯示，在43 000 處出現(xiàn)新的蛋白帶，而空載體組、空白細胞組的細胞裂解產(chǎn)物未出現(xiàn)該條帶，見圖6。細胞裂解產(chǎn)物經(jīng)電泳并轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，DAB 顯色后結(jié)果顯示:在相對分子質(zhì)量為43 000 處出現(xiàn)一著色條帶，空載體轉(zhuǎn)化組、空白細胞組的細胞裂解產(chǎn)物也未出現(xiàn)顯色條帶。見圖7。

圖6 轉(zhuǎn)染細胞的SDS-PAGE 分析Figure 6 The analysis of transferred cells by SDS-PAGE

圖7 轉(zhuǎn)染細胞的Western blot 分析Figure 7 The analysis of transferred cells by Western blot

3 討 論

單純皰疹病毒Ⅱ型又稱人類皰疹病毒Ⅱ、生殖器皰疹病毒，屬于皰疹病毒科。該病毒編碼72 個基因，共編碼70 多種蛋白質(zhì)，30 多種不同蛋白組成病毒結(jié)構(gòu)蛋白［5］。在HSV-2 編碼的糖蛋白中，gD 是產(chǎn)生中和抗體的主要糖蛋白，是HSV 主要的免疫原，能誘導(dǎo)體液和細胞免疫，產(chǎn)生高滴度中和抗體，激發(fā)DTH 反應(yīng)及T 細胞增殖反應(yīng)。gD 與受體“皰疹病毒進入介導(dǎo)子”作用，參與病毒穿膜過程，介導(dǎo)病毒胞間擴散，是抗HSV 感染中重要的保護性抗原［6－8］，這也是我們在本研究中將gD 作為疫苗靶點的主要原因。

DC 與人體免疫功能密切相關(guān)，被認為是體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細胞，能夠激活T 淋巴細胞，產(chǎn)生CTL，啟動人體的特異性免疫，溶解殺傷腫瘤細胞，因此DC 成為研究腫瘤、病毒免疫治療的熱點［9］。DC疫苗是指負載了特異性抗原的成熟的DC。利用病原載體將帶有病原體抗原的編碼基因轉(zhuǎn)染DC，使DC持續(xù)表達特異性抗原，能誘導(dǎo)人體產(chǎn)生抗感染效應(yīng)，產(chǎn)生CTL，從而殺傷病原體感染的細胞［10］?；蜣D(zhuǎn)染是DC 負載腫瘤抗原的有效手段，與傳統(tǒng)的腫瘤肽疫苗相比，基因轉(zhuǎn)染可使抗原基因在DC 中更持久的表達，因而有效引發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)［11－14］。

在本實驗中，我們重組的腺病毒轉(zhuǎn)染DC 后，RT-PCR 結(jié)果說明HSV-2 gD 能在DC 中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，其攜帶外源基因HSV-2 gD 能在DC 中被成功轉(zhuǎn)錄成mRNA。SDS-PAGE 結(jié)果顯示HSV-2 gD 可以在轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)表達。免疫組化和Western blot 可檢測到具有免疫原性的gD 蛋白的表達。這些結(jié)果說明我們成功制備了腺病毒介導(dǎo)的HSV-2 gD 基因修飾的樹突狀細胞疫苗，下一步我們將探討該疫苗在動物水平的免疫效應(yīng)。

［1］ Gupta R，Wald A.Genital herpes:antiviral therapy for symptom relief and prevention of transmission［J］.Expert Opin Pharmacother，2006，7(6):665-675.

［2］ 樊建勇，楊慧蘭，王 穎，等.單純皰疹病毒2gD-Hsp70 融合蛋白基因的構(gòu)建及表達［J］.生物工程學(xué)報，2006，22(6):914-918.

［3］ Fan J，Yang H.Construction and immune response of HSV-2gDHsp70 DNA vaccine［J］.J Dermatol Sci，2010，57(1):64-66.

［4］ 樊建勇，楊慧蘭.脂質(zhì)體包裹HSV-2gD-Hsp70 融合蛋白的免疫應(yīng)答研究［J］.中華皮膚科雜志，2007，40(10):609-612.

［5］ 金 奇.醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001:716-736.

［6］ Haddow LJ，Mindel A.Genital herpes vaccines--cause for cautious optimism［J］.Sex Health，2006，3(1):1-4.

［7］ Subak-Sharpe JH，Dargan D.HSV molecular Biology:general aspects of herpes simplex virus［J］.Virus Genes，1998，16(3):239-251.

［8］ Whitley RJ，Roizman B.Herpes simplex virus infections［J］.Lancet，2001，357(9267):1513-1518.

［9］ 謝軍平，葉小群，況九龍.體外樹突狀細胞疫苗策略抗腫瘤免疫治療研究進展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，22(30):49-52.

［10］ Litjens NH，Huisman M，Baan CC，et al.Hepatitis B vaccinespecific CD4+T cells can be detected and characterised at the single cell level:limited usefulness of dendritic cells as signal enhancers［J］.J Immunol Methods，2008，330(1-2):1-11.

［11］ Lizee G，Gonzales MI，Topalian SL.Lentivirus vector-mediated expression of tumor-associated epitopes by human antigen presenting cells［J］.Hum Gene Ther，2004，15(4):393-404.

［12］ 姜明子，馮旰珠.重組銅綠假單胞菌外毒素A 和pcrV 基因質(zhì)粒的構(gòu)建及真核表達［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27(7):694-697.

［13］ 陳 偉，曹 罡，董 震，等.人Notch4 基因RNAi 慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26(2):116-121.

［14］ 董 杰，王龍信，唐朝朋，等.轉(zhuǎn)化生長因子β 不敏感的樹突狀細胞疫苗對腎細胞癌荷瘤小鼠細胞毒性T 淋巴細胞的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26(5):455-459.