李 桃，王漢東，丁 宇，何 進，丁 可，陸新宇，徐建國，韋武亭

0 引 言

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)在臨床上高致死和高致殘率，并且伴嚴重后遺癥［1－3］。SAH 后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制復雜，而腦內小膠質細胞/巨噬細胞(microglia/macrophage，M/M)在SAH 腦組織損傷和修復中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，M/M 在腦損傷后可發(fā)揮加重損傷或促進損傷修復的雙重作用［4］。根據(jù)產(chǎn)生和分泌的炎癥因子的不同，將活化的M/M 分為經(jīng)典活化型和替代活化型［5－7］，經(jīng)典活化型也稱為M1 型，主要產(chǎn)生一系列促炎因子，如誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6 及細胞趨化因子，在誘導白細胞遷移并消滅外來病原微生物方面發(fā)揮重要作用;替代活化型也稱為M2 型，主要產(chǎn)生如精氨酸酶1(arginase1，Arg1)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-10 等一系列抗炎因子，在吞噬壞死組織碎片和促進組織再生修復中發(fā)揮重要作用［4］。在實驗性小鼠腦梗塞和腦外傷等腦損傷早期，活化的M/M 主要表現(xiàn)為M1 型［6－7］，產(chǎn)生各種促炎因子和活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，加重繼發(fā)性腦損傷。研究表明，炎癥反應、炎癥細胞活化和氧化應激在SAH 后繼發(fā)性損傷中發(fā)揮了重要作用，而小膠質細胞活化可能是影響SAH 后繼發(fā)性腦損傷的一個重要因素。核因子NF-E2 相關因子2(nuclear factor erythroid2 factor 2，Nrf2)為細胞內調控抗氧化酶和II相解毒酶的主要因子，活化后可減輕和抑制過激的氧化應激和炎癥反應［8］。Nrf2 基因敲除小鼠在SAH 后炎癥因子和氧化應激產(chǎn)物增加，加重繼發(fā)性腦損傷［9］。此外，在小鼠阿爾茨海默病模型中，Nrf2 基因敲除促進了小膠質細胞M1 型極化產(chǎn)物的表達［10］。因此，Nrf2 可能為調節(jié)M/M 活化的重要因子。本研究應用小鼠SAH 模型來明確SAH 后M/M 活化，以及Nrf2 基因敲除對M/M 活化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型的建立 健康雄性野生型ICR 小鼠(70 只)及Nrf2 基因敲除小鼠(35 只)均由我院比較醫(yī)學科提供，體重30 ～35 g，實驗動物合格證號:CXK(軍)2007-012。動物飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境，正常光照，自由飲水。環(huán)境溫度25 ℃。將小鼠按隨機數(shù)字表法分為野生型假手術組、野生型SAH 組、基因敲除假手術組和基因敲除SAH 組。小鼠采用自體血視交叉注射建立SAH 模型［9］。假手術組行同樣抽血、鉆孔及置針，但不行注血，術后放回鼠籠，置25 ℃空洞房間，自由飲食飲水。

1.2 主要試劑 DNA 提取試劑盒(GK0124，上海捷瑞生物工程有限公司)，羊抗小鼠Iba1 抗體(1∶500，abcom，美國)，β-actin 抗體(1∶3000，bioworld，美國)，羊抗兔HRP 二抗(1∶3000，bioworld，美國)，驢抗羊HRP 二抗(1∶100，北京中杉金橋生物技術有限公司)，驢抗兔熒光二抗(1∶500，Jackson，美國)，驢抗大鼠熒光二抗(1∶500，Jackson，美國)，組織裂解液、5X 上樣緩沖液、PMSF 蛋白酶抑制劑、ECL 發(fā)光液、免疫染色封閉液、免疫染色抗體稀釋液(碧云天生物技術研究所)，免疫組化SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 標本準備 小鼠經(jīng)水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射麻醉，固定于木板上，經(jīng)左心室灌注等滲鹽水至肝蒼白(約10 min)。標本經(jīng)等滲鹽水灌注后斷頭取腦，取雙側顳葉底面共約50 mg 腦組織立即置于液氮中待用，用Western blot 法檢測。標本經(jīng)等滲鹽水灌注沖洗后，繼續(xù)灌注20mL 中性甲醛溶液固定，取整個大腦置于中性甲醛中浸泡過夜，次日經(jīng)0.01 mol/L PBS 洗滌后，冠狀切取包含挫傷區(qū)腦組織并進行石蠟包埋，4 μm 厚切片，用于免疫組化檢測。次日經(jīng)0.01 mol/L PBS 洗滌后浸泡于含20%蔗糖的0.01 mol/L PBS 溶液中，帶標本沉底，換為30%的蔗糖溶液浸泡至腦組織沉底，OCT 膠包埋后10 μm 冰凍切片，－80 ℃凍存?zhèn)溆?，用于免疫熒光檢測。假手術組于術后24 h 取標本，SAH 組于SAH 術后第1、3、5 天留取標本。

1.4 免疫組化染色檢測 切片常規(guī)脫蠟水化，0.01 mol/L(pH 6.0)枸櫞酸緩沖液抗原修復，3%H2O2室溫20 min，免疫染色封閉液室溫20 min，0.01 mol/L PBS 稀釋的一抗2 h，PBS 漂洗，依據(jù)免疫組化試劑盒和DAB 顯色試劑盒說明書步驟進行，最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，顯微鏡觀察。每組選取3 只鼠腦組織切片，每張切片隨機選取5個視野(400 倍)拍照，采用Image pro plus 軟件計算陽性染色的平均光密度值。

1.5 免疫熒光染色檢測 切片復溫，0.01 mol/L PBS 漂洗，BSA 封閉，一抗4 ℃過夜，PBS 漂洗，二抗室溫2 h，PBS 漂洗，DAPI 染核2 min，PBS 漂洗，熒光抗淬滅劑封固，顯微鏡觀察。每組選取3 只鼠腦組織切片，每張切片隨機選取5 個視野(×400)拍照，采用Photoshop CS3 軟件進行細胞計數(shù)。

1.6 Western blot 檢測 從液氮中取出標本，腦組織經(jīng)稱重后置于研磨管，按比例加人預冷的組織裂解液后研磨，在冰上裂解0.5 h，將裂解物在標準離心機上以離心半徑10 cm、12 000 r/min，4 ℃下離心10 min，收集上清，考馬斯亮藍法測定總蛋白含量。抽取部分上清液，按4∶1 加入上樣緩沖液，并于100 ℃沸水中煮沸10 min。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、5%脫脂牛奶封閉、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜及普通ECL 化學發(fā)光法化學檢測等處置后，膠片掃描保存并用ImageJ 2.0 軟件進行分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差)表示，多組間比較采用單因素方差分析和Bonferroni 法，方差不齊時采用近似F 檢驗Welch 法進行比較。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠SAH 建模基本情況 SAH 建模后血液主要沉積在前顱底和雙側顳葉底面。與假手術小鼠相比，SAH 后小鼠大腦底面顳葉有較多血液沉積。小鼠在麻醉和注血過程中出現(xiàn)的死亡不計入死亡率，假手術組無小鼠死亡，SAH 造模后24 h 內野生型小鼠，基因敲除小鼠各死亡5 只。

2.2 野生型SAH 組M/M 活化情況

2.2.1 Western blot 檢測 SAH 術后第1、3、5 天野生型假手術組和野生型SAH 組小鼠Iba1 蛋白表達量均較假手術組明顯增高(P ＜0.05)，但第3 天與第5 天蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見圖1，表1。

2.2.2 免疫組織化學檢測 野生型假手術組Iba1免疫染色可見M/M 分布稀疏，胞體較小，細胞突觸多而細。SAH 后可見顳葉皮層下M/M 數(shù)量明顯增加，體積增大，分布密集，突起變粗等改變。經(jīng)平均光密度值分析，SAH 后第1、3、5 天Iba1 蛋白表達量較假手術組明顯增高(P ＜0.05)，但第3 天與第5天Iba1 蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見圖2，表1。

圖1 Western blot 法檢測野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表達Figure 1 Iba1 expression by western blot after SAH in wild-type mice

圖2 顯微鏡下觀察野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表達(IHC ×400)Figure 2 Iba1 expression by immunohistochemistry after SAH in wild-type mice(IHC ×400)

表1 野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表達Table 1 Iba1 expression after SAH in wild-type mice

表1 野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表達Table 1 Iba1 expression after SAH in wild-type mice

與假手術組比較，*P ＜0.05

分組 n 灰度值Ib比a1 蛋白平表均達光密度值野生型假手術組5 0.491±0.039 0.412±0.122野生術術術型后后后第第第SA 135 H天天天 組 555 000...699 532 706±±±000...000 644 966***000...699 267 538±±±000...122 312 534***

2.3 Nrf2 基因敲除促進M/M 活化和M1 極化

2.3.1 Western blot 檢測Iba1 蛋白表達 SAH 后第3 天，野生型和基因敲除SAH 組較對應假手術組Iba1 蛋白表達明顯增加(P ＜0.05)，基因敲除SAH組較野生型SAH 組Iba1 蛋白表達增加明顯(P ＜0.05)。見圖3，表2。

2.3.2 免疫熒光檢測 野生型和基因敲除假手術組可見少量Iba1 染色的細胞，胞體較小，細胞突觸多而細。SAH 后第3 天，顳葉皮層下Iba1+染色細胞數(shù)量明顯增加，體積增大，而且基因敲除SAH 組較野生型SAH 組增加明顯。野生型和基因敲除假手術組幾乎未發(fā)現(xiàn)CD16/32+Iba1+染色細胞，SAH后第3 天CD16/32+Iba1+染色細胞明顯增加，且基因敲除SAH 組較野生型SAH 組增加明顯。SAH 后第3 天基因敲除組CD16/32+Iba1+細胞計數(shù)較野生型組增加明顯(P ＜0.05)。見圖4，表2。

圖3 Western blot 檢測小鼠SAH 后Iba1 蛋白表達Figure 3 Iba1 expression by Western blot after SAH between two types of mice

圖4 小鼠SAH 后第3 天CD16/32+Iba1+細胞表達(IF ×400)Figure 4 CD16/32+Iba1+expression 3 d after SAH between two types of mice(IF ×400)

表2 小鼠SAH 后Iba1 蛋白表達和CD16/32+Iba1+細胞計數(shù)Table 2 Iba1 expression and CD16/32+Iba1+cell number after SAH between two types of mice

表2 小鼠SAH 后Iba1 蛋白表達和CD16/32+Iba1+細胞計數(shù)Table 2 Iba1 expression and CD16/32+Iba1+cell number after SAH between two types of mice

與對應假手術組比較，*P ＜0.05;與野生型SAH 組比較，#P ＜0.05

組別 n Iba1 蛋白表達 CD16/32+Iba1+細胞數(shù)(個/HP)野生型假手術組組5 1.157±0.080 0基因敲除假手術組 5 1.162±0.073 0野生型SAH 組 5 1.580±0.171* 30.200±6.300*基因敲除SAH 組 5 1.913±0.220*# 42.800±6.260*#

3 討 論

研究表明，SAH 后炎性細胞活化、氧化應激及炎性反應在繼發(fā)性腦損傷和進行性神經(jīng)功能障礙中發(fā)揮著重要作用［2］。

腦損傷后腦內固有小膠質細胞被迅速活化，產(chǎn)生炎癥因子、趨化因子和活性氧自由基等，并誘導血液中游離的炎癥細胞遷移入損傷的腦組織，進一步加重炎癥反應和氧化應激，加重繼發(fā)性損傷。腦內小膠質細胞被認為與外周巨噬細胞同源，因此叫做M/M［4］。正常生理條件下M/M 活化較少，主要是免疫監(jiān)視作用;在腦外傷、腦出血及腦梗死等疾病情況下，小膠質細胞的數(shù)量可迅速增加和活化，產(chǎn)生“呼吸爆發(fā)”反應，釋放出大量的氧自由基和炎癥因子，并在疾病的進展中發(fā)揮重要作用［10］。小膠質細胞活化后既可產(chǎn)生炎癥因子又可產(chǎn)生抗炎和營養(yǎng)因子。在實驗性小鼠腦梗塞和腦外傷等腦損傷后，早期活化的M/M 主要為M1 型，產(chǎn)生各種促炎因子［6－7］。因此，在腦損傷后早期，活化并呈M1 型極化狀態(tài)的M/M 可能是加重繼發(fā)性腦損傷的重要因素。而且在Hanafy 的實驗中，用氯膦酸鹽去除M/M能夠明顯減少小鼠SAH 后海馬神經(jīng)元凋亡［13］，說明M/M 在SAH 后繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮了重要作用。本研究表明小鼠SAH 后M/M 標志物Iba1 蛋白表達增加，Iba1 免疫組化陽性細胞數(shù)量增加且體積增大，表明M/M 在SAH 后被誘導活化。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，SAH 后第3 天大部分活化的M/M 可表達M1 極化標志物CD16/32。因此，小鼠SAH 后M/M可被誘導活化和M1 型極化。

Nrf2 為細胞內核轉錄因子，當被氧化應激源刺激后轉移入核，結合到抗氧化反應原件并啟動一系列抗氧化酶和解毒酶的表達［8］。研究表明，增加Nrf2 的活化可抑制過激的氧化應激和炎癥反應，減輕小鼠腦外傷、腦出血及腦梗死引起的繼發(fā)性損傷［12－14］，而Nrf2 基因敲除小鼠在腦外傷、腦出血和腦梗塞后表現(xiàn)為繼發(fā)性損傷加重［11－15］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 基因敲除促進腦外傷后氧化應激和炎癥反應，促進小膠質細胞的活化，加重神經(jīng)細胞凋亡和神經(jīng)功能障礙［16］，而且，細胞內氧化還原狀態(tài)能夠調控巨噬細胞M1 型與M2 型的極化狀態(tài)［17］。因此，我們認為Nrf2 對腦損傷后M/M 的活化和極化有重要調控作用。本實驗的結果發(fā)現(xiàn)，Nrf2 基因敲除促進了SAH 后Iba1 蛋白表達增加，說明Nrf2基因敲除促進了M/M 的活化;而且，免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Nrf2 基因敲除促進SAH 后CD16/32+Iba1+細胞的增加，無Nrf2 的作用，M/M 在SAH 后M1 型極化增加。因此，Nrf2 基因敲除促進了小鼠SAH 后M/M 活化和M1 極化，這與我們的前期研究中Nrf2 基因敲除加重小鼠SAH 腦損傷相符合［9］。

綜上所述，SAH 后M/M 被誘導活化和M1 極化，Nrf2 基因敲除加重了SAH 后小膠質細胞/巨噬細胞的活化和M1 極化。Nrf2 對SAH 后M/M 活化及極化具有重要調控作用。

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