劉向六，劉文學(xué)，邱麗麗，張廣芬，周志強(qiáng)

0 引 言

全身麻醉藥氯胺酮屬于非選擇性N-甲基-D-天(門)冬氨酸(N-methyl-d-aspartate，NMDA)受體拮抗劑。近年來大量臨床及基礎(chǔ)研究均表明氯胺酮具有快速、顯著的抗抑郁作用，但具體作用機(jī)制仍不清楚［1－4］。既往研究表明氯胺酮可影響中樞興奮/抑制平衡［4－6］，可能在其抗抑郁中發(fā)揮作用。本研究擬觀察抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)在氯胺酮抗抑郁中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康雄性Wistar 大鼠，32只，體重200 ～250 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，實(shí)驗(yàn)動物合格證號:0016668。在室溫25 ℃、相對濕度為45%的動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，自由飲水，標(biāo)準(zhǔn)飲食。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠均分為等滲鹽水組、氯胺酮組、GABA 組及GABA+氯胺酮組，每組8 只。

1.2 側(cè)腦室置管 所有大鼠均進(jìn)行側(cè)腦室置管(導(dǎo)管及給藥系統(tǒng)購于深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。過程如下:麻醉后將大鼠固定于立體定位儀上，暴露前囟，坐標(biāo)尺向后1.0 mm，旁開1.5 mm，自硬腦膜面向下3.5 mm。22 號導(dǎo)管置管，玻璃離子水門汀固定，單籠飼養(yǎng)1 周。給藥時(shí)使用。

1.3 藥物干預(yù) 術(shù)后第8 天行強(qiáng)迫游泳15 min 制備急性應(yīng)激抑郁模型。造模后24 h，經(jīng)26 號注射內(nèi)管進(jìn)行側(cè)腦室給藥，等滲鹽水組及氯胺酮組給予等滲鹽水2 μL，GABA 組及GABA+氯胺酮組給予GABA 50 μg(2 μL，美國Sigma 公司)，GABA 劑量選擇依據(jù)文獻(xiàn)［7］。側(cè)腦室給藥后10 min 等滲鹽水組及GABA 組腹腔注射等滲鹽水1 mL，氯胺酮組及GABA+氯胺酮組腹腔注射氯胺酮10 mg/kg(1 mL，福建古田制藥廠)。

1.4 敞箱實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT) 腹腔給藥后30 min 應(yīng)用OFT 進(jìn)行大鼠自主活動評分，由2 名經(jīng)過培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測評，取平均分。實(shí)驗(yàn)在1 個(gè)底面積為75 cm×75 cm、高40 cm 的敞箱內(nèi)進(jìn)行，底部均分為25 個(gè)方格。每只大鼠放在清潔敞箱的中央格，記錄大鼠在5 min 內(nèi)的各項(xiàng)得分。水平得分為大鼠水平穿越的方格數(shù)，大鼠3 或4 爪都進(jìn)入1 個(gè)方格記為1 分;垂直得分為兩前爪每離開底面1 次記為1 分。

1.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST)參考以往研究［8－9］，采用大鼠FST 建立急性應(yīng)激抑郁模型，即將大鼠置于高65 cm、直徑30 cm、盛有23 ℃～25 ℃自來水的清潔圓柱形玻璃缸中，水深40 cm，游泳15 min。OFT 后即刻將大鼠置入玻璃缸中行FST 6 min 進(jìn)行測試，觀察并記錄后5 min 大鼠的不動時(shí)間。行為學(xué)測試由2 名經(jīng)過培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法測評，取平均值。

1.6 GABA 含量測定 行為學(xué)測試結(jié)束后，取大鼠大腦前額皮層，采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)測定GABA 水平。向預(yù)先包被了大鼠GABA 單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入待測樣品40 μL，37 ℃溫育60 min，加生物素標(biāo)記的抗GABA 抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入顯色劑，37 ℃避光顯色10 min，加終止液終止反應(yīng)。在450 nm 處測光密度(A)值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中GABA 含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氯胺酮對FST 大鼠不動時(shí)間的影響 與氯胺酮組比較，等滲鹽水組、GABA組、GABA+氯胺酮組不動時(shí)間增加(P ＜0.05)，與GABA組比較，GABA+氯胺酮組不動時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

2.2 氯胺酮對大鼠前額皮層GABA 含量的影響

與氯胺酮組比較，等滲鹽水組、GABA 組、GABA+氯胺酮組大鼠前額皮層GABA 含量均升高(P ＜0.05)，與GABA 組比較，GABA+氯胺酮組大鼠前額皮層GABA 含量下降(P ＜0.05)。見表1。

表1 氯胺酮對FST 大鼠不動時(shí)間和前額皮層GABA 含量的影響Table 1 The effects of ketamine on the immobility time of FST and GABA level in prefrontal cortex in rats

表1 氯胺酮對FST 大鼠不動時(shí)間和前額皮層GABA 含量的影響Table 1 The effects of ketamine on the immobility time of FST and GABA level in prefrontal cortex in rats

與氯胺酮組比較，*P ＜0.05;與GABA 組比較，#P ＜0.05

組別 n 不動時(shí)間(s) 前額(n皮g層/mg G·A B pr Ao t含)量等滲鹽水組 8 167.2±22.1* 23.3±6.3*氯胺酮組 8 107.5±21.2 12.4±3.4 GABA 組 8 159.8±17.5* 27.3±5.7*GABA+氯胺酮組 8 143.8±22.1* 18.0±5.4*#

2.3 氯胺酮對大鼠OFT 水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動的影響 4 組大鼠水平運(yùn)動OFT 得分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，垂直運(yùn)動OFT 得分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。見表2。

表2 氯胺酮對大鼠OFT 水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動的影響，分)Table 2 The effects of ketamine on the crossing and the rearing scores of OFT in rats，score)

表2 氯胺酮對大鼠OFT 水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動的影響，分)Table 2 The effects of ketamine on the crossing and the rearing scores of OFT in rats，score)

分組 n 水平運(yùn)動O F T得分垂直運(yùn)動等滲鹽水組8 54.250±6.884 7.625±1.782氯胺酮組 8 50.750±7.842 6.375±1.475 GABA 組 8 52.375±7.421 7.625±1.908 GABA+氯胺酮組8 52.125±8.993 7.000±1.309

3 討 論

抑郁癥狀為心境障礙的一種臨床癥狀，抑郁癥是以顯著而持久的心境低落、思維遲緩、認(rèn)知功能損害、意志活動減退和軀體癥狀為主要臨床特征的一類心境障礙［10］。強(qiáng)迫游泳所致抑郁模型屬于行為絕望模型，當(dāng)大鼠被迫在局限的空間游泳，它們首先拼命地泳動試圖逃跑，隨后處于一種漂浮的不動狀態(tài)，僅露出鼻孔維持呼吸，四肢偶爾劃動以保持身體不至于沉下去，這種狀態(tài)即不動狀態(tài)，屬于“行為絕望”。該模型具有簡單、快速、敏感等特點(diǎn)，目前國內(nèi)外關(guān)于探討氯胺酮抗抑郁機(jī)制的研究絕大多數(shù)采用此模型，因此在本實(shí)驗(yàn)中也選用此模型。本研究結(jié)果顯示，氯胺酮10 mg/kg 給藥后30 min，大鼠FST 不動時(shí)間明顯下降，再次證實(shí)了氯胺酮快速有效地抗抑郁作用。

GABA 是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的主要類型，GABA 增多能夠抑制興奮性神經(jīng)元，導(dǎo)致興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸合成減少，從而減弱突觸再生相關(guān)信號，促進(jìn)抑郁癥發(fā)生［11－12］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮在大鼠急性抑郁模型中產(chǎn)生確切的抗抑郁作用，同時(shí)伴隨大鼠前額皮層GABA 下調(diào)，這提示氯胺酮的抗抑郁作用可能與GABA 下調(diào)有關(guān)［4］。本研究采用側(cè)腦室給藥預(yù)先補(bǔ)充GABA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予氯胺酮后并未減少大鼠FST 不動時(shí)間。氯胺酮給藥后30 min 大鼠前額皮層GABA 含量顯著下降，側(cè)腦室補(bǔ)充GABA 后大鼠前額皮層GABA 含量增加，同時(shí)阻斷了氯胺酮抗抑郁作用。雖然與GABA 組相比，GABA+氯胺酮組大鼠前額皮層GABA 含量顯著下降，但兩組之間FST 不動時(shí)間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是側(cè)腦室給藥后大鼠腦組織GABA 基礎(chǔ)含量較高從而導(dǎo)致氯胺酮未能發(fā)揮抗抑郁作用。根據(jù)以上結(jié)果并結(jié)合以往研究，推測氯胺酮可能通過抑制大鼠前額皮層GABA 生成，從而減弱對興奮性神經(jīng)元的抑制作用，導(dǎo)致谷氨酸水平升高，進(jìn)一步激活突觸再生相關(guān)信號，促進(jìn)突觸再生，從而產(chǎn)生抗抑郁作用。

另外本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室單獨(dú)給予GABA對大鼠不動時(shí)間無明顯影響，且各組大鼠水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動等運(yùn)動能力評分無顯著差異，實(shí)驗(yàn)過程中大鼠均未死亡，據(jù)此可排除實(shí)驗(yàn)操作及藥物處理對大鼠自主活動的影響。

有關(guān)GABA 對突觸后相關(guān)信號通路分子的影響及在氯胺酮抗抑郁中的作用尚需更多的研究來闡明，以期為研發(fā)快速有效的新型抗抑郁藥提供理論參考。

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