高春林，夏正坤，樊忠民，高遠(yuǎn)賦

0 引 言

Alport 綜合征(Alport Syndrome，AS)是一種進(jìn)行性的遺傳性腎小球疾病，表現(xiàn)為鏡下血尿或肉眼血尿，可伴有蛋白尿，聽力及視覺異常，可進(jìn)展至終末期腎?。?-2］，是危及兒童及青少年生命健康的重要疾病之一［3］。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展及診療水平的提高，其發(fā)病率呈上升趨勢。據(jù)2008 年北美兒童腎臟實(shí)驗(yàn)及合作性研究中心的數(shù)據(jù)顯示，Alport 綜合征患兒腎移植占同期兒童期腎移植的2.3%，占兒童期血液透析的1.9%，其發(fā)病率為1 ∶5000 活產(chǎn)兒［4］。其病因?yàn)榫幋aⅣ型膠原α3、α4、α5 鏈的基因突變所致，其中α3、α4 基因突變所致為常染色體顯性或隱性遺傳，α5 鏈基因突變所致為X 染色體連鎖的顯性遺傳［5-7］。迄今為止已有近700 個基因突變被發(fā)現(xiàn)［8］。大部分的突變所致Ⅳ型膠原α3、α4、α5鏈的異常可通過免疫熒光檢測皮膚或腎組織相應(yīng)鏈的異常而診斷，但少數(shù)突變免疫熒光方法顯示Ⅳ型膠原α3、α4、α5 鏈無缺失而導(dǎo)致無法確診。本研究利用高通量第2 代測序技術(shù)對一中國漢族家系進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一新的α5 鏈缺失突變，為國內(nèi)外首次報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 先證者，男，4 歲3 個月，因肉眼血尿15 個月就診?；颊哂诤粑栏腥竞蟪霈F(xiàn)肉眼血尿，表現(xiàn)為全程肉眼血尿，濃茶色，不伴有尿頻尿急尿痛，無嘔吐腹痛，無頭痛，無少尿。查血尿?yàn)槎嘈涡脱颍虺猎?jì)數(shù)在3000 ～7000 萬/mL，抗炎治療無效。查體:心率88 次/min，呼吸23 次/min，血壓96/68 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，神志清楚，精神反應(yīng)好，全身未見浮腫，無皮疹，心肺腹部查體無異常。神經(jīng)系統(tǒng)體征陰性。聽力及眼底無異常。父母非近親結(jié)婚，家族中有類似病史。入院后結(jié)果:血常規(guī)三系在正常范圍，肝腎功能及血脂電解質(zhì)正常，自身抗體及補(bǔ)體正常，乙型肝炎病毒病原學(xué)檢測及傳染病4 項(xiàng)結(jié)果正常。雙腎大小在正常范圍，無腎結(jié)石及左腎靜脈受壓，心電圖及X 線胸片正常。尿蛋白(+)，尿紅細(xì)胞滿視野，尿沉渣計(jì)數(shù)在5000 ～7000 萬/mL，多形型。見表1。

家系調(diào)查:家族3 代，共計(jì)7 例患者，男4 例，女3 例，其中男性患者表現(xiàn)重，除了明顯肉眼血尿外，先證者舅舅已行腎移植，先證者及其胞弟、表兄表現(xiàn)為肉眼血尿。3 例女性患者，先證者外祖母以血液凈化維持生命。先證者外祖父及外祖母均未患病，亦非近親結(jié)婚。見表1，圖1。

表1 患者家系血(尿)液電解質(zhì)及臨床資料特點(diǎn)Table 1 Clinical data of the 7 patients

圖1 患者家系圖Figure 1 Pedigree diagram of the Chinese family with Alport syndrome

1.2 病理研究方法 采用B 超引導(dǎo)下經(jīng)皮負(fù)壓式腎活檢術(shù)，活檢腎組織按常規(guī)方法進(jìn)行光免疫熒光和電鏡檢查。

1.3 DNA 測序研究方法

1.3.1 基因組DNA 提取 抽取受檢者的外周血約3 mL。用 QIAamp 外 周 血 DNA 提 取 試 劑 盒(QIAamp，德國)，按其指南提取基因組DNA。本研究征得本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬同意并簽署知情同意書。

1.3.2 COL4A3/COL4A5/COL4A4 基因序列獲取 從數(shù)據(jù)庫NCBI 獲取人類COL4A3/COL4A5/COL4A4 基因DNA 序列。

1.3.3 DNA 測序 ①外顯子測序 用BGI 的定制芯片NimbleGen Sequence Capture Arrays 結(jié)合Illumina Hiseq 2000 的高通量測序技術(shù)，根據(jù)Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫說明書，將基因組DNA 隨機(jī)打斷成200 ～300 bp 的片段，隨后在片段兩端分別連接上接頭制備雜交文庫，文庫經(jīng)純化后經(jīng)過ligation-mediated PCR(LM-PCR)的線性擴(kuò)增與捕獲試劑進(jìn)行雜交富集，再經(jīng)過LM-PCR 的線性擴(kuò)增后進(jìn)行上機(jī)測序。測序平臺為Illumina Hiseq 2000，讀取長度為90 bp，每個樣本的平均測序深度最少為150×。測序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Software 1.7 進(jìn)行處理，經(jīng)過過濾去污染、使用SOAPaligner 2.20 比對參考基因組，獲得比對到基因組上的Unique mapped reads。靶區(qū)域的基因型由SOAPsnp 確定。對結(jié)果通過dbSNP 數(shù)據(jù)庫，HapMap 數(shù)據(jù)庫，千人基因組數(shù)據(jù)庫等公共數(shù)據(jù)庫的過濾，最終只保留編碼區(qū)上的非同義突變。②sanger 測序驗(yàn)證 分別對3名患者、4 名家系內(nèi)未發(fā)病成員進(jìn)行檢測，針對COL4A5 基 因c.1365_1373delTCCAGGCCC 突 變設(shè)計(jì)引物，通過PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，利用Primer Premier 5 軟件自行設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增COL4A5 基因21號外顯子編碼區(qū)及剪切位點(diǎn)的引物，并由英捷(上海)貿(mào)易有限公司合成。COL4A5 引物序列為:F:CATTCCTGGACCTCCTGGACTTGA R:CATTCCTGGACCTCCTGGACTTGA。PCR 條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;60 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，15 ℃保存。PCR 產(chǎn)物測序:用Big Dye Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 美國)按廠商的步驟進(jìn)行。

1.3.4 測序結(jié)果分析方法 測序結(jié)果用Mutation Surveyor V4.0.5(demo)軟件(美國Softgenetics 公司)分析，所得序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的COL4A3/COL4A5/COL4A4 基因序列進(jìn)行比對。堿基變異參考人類基因組變異研究學(xué)會制定的序列變異命名的命名法則，以GenBank cDNA 序列的翻譯起始密碼子ATG 中的A 為+1 位核苷酸進(jìn)行命名。物種間保守性分析采用在線分析軟件［9］。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡結(jié)果 腎病理:22 個小球，未見硬化，腎小球體積稍大，細(xì)胞數(shù)增多，100 ～120 個/小球系膜細(xì)胞4 ～6/hp，系膜基質(zhì)輕-中度增寬，毛細(xì)血管袢開放可，基底膜無增厚，部分小球輕微球囊粘聯(lián)，Masson 染色陰性，小管間質(zhì)病變輕，小灶性小管萎縮，間質(zhì)區(qū)無明顯異常，IgM+。

2.2 電鏡結(jié)果 先證者腎組織表現(xiàn)為少量足突融合，上皮下可見電子致密物沉積，而基膜無明顯變薄，無分裂。缺乏AS 的典型表現(xiàn)。

2.3 Ⅳ型膠原免疫熒光檢測 免疫熒光檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是皮膚α5 鏈還是腎組織的α3、α5 鏈均表現(xiàn)為正常，無缺損表現(xiàn)。不符合典型AS 的表現(xiàn)。

2.4 測序結(jié)果 對先證者測序發(fā)現(xiàn)COL4A5(NM_000495)上的存在1 個可疑突變即c.1365_1373 delTCCAGGCCC(p.Pro456_Pro458del3)，即在此基因上缺失1365_1373 處的堿基，見圖2，導(dǎo)致此基因編碼的蛋白在456 ～458 位發(fā)生缺失，較之野生型蛋白的1685 個AA，突變型蛋白僅有1682 個Aa。此突變沒有相關(guān)報(bào)道，為已知基因新突變。

Sanger 測序進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)所有未受累的男性家族成員均不帶有該突變，女性帶有雜合突變，3 個男性患者均帶有純合c.1365_1373delTCCAGGCCC(p.Pro456_Pro458del3)突變，結(jié)合此疾病具有外顯率的情況，在家系內(nèi)證明基因型與表型存在共分離，證明該突變?yōu)樵摷蚁档闹虏⌒酝蛔?。結(jié)合家系圖譜及患者情況，以及此類疾病X 連鎖存在女性外顯率不全的情況，符合X 連鎖遺傳模式。

利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，由于這9 個堿基的缺失，導(dǎo)致456-458 位的3 個氨基酸(PGP)缺失，該缺失正好位于2 個G-X-Y 中間(CEPGPPGPPGSPGDKGLQGEQGVKGDKGDT)，形成缺失了1 個GX-Y(GPP)的序列，該缺失序列在各物種間高度保守，見表2。

圖2 COL4A5 基因的部分測序結(jié)果Figure 2 Part of the COL4A5 gene sequencing results for the index case and his family members

表2 各物種間序列(TCCAGGCCC)的保守性分析Table 2 Conservative analysis of the sequence(TCCAGGCCC)among different species

3 討 論

AS 最早于1927 年被首次報(bào)道［10］，隨著醫(yī)療技術(shù)水平的整體提高，兒童AS 的診斷率也日漸提高，是目前導(dǎo)致兒童終末期腎病的重要疾病之一。由于其屬于遺傳性疾病，進(jìn)展致終末期腎病的過程無法逆轉(zhuǎn)，治療方法有限，因此該病對患兒健康危害極大，而引起兒科醫(yī)生的高度關(guān)注。

從該家系的臨床表現(xiàn)看，符合X 連鎖顯性遺傳規(guī)律，本研究根據(jù)其陽性家族史血尿表現(xiàn)，盡管缺乏腎外受累表型，但仍高度懷疑AS。由此，本研究期望通過腎臟病理及Ⅳ型膠原的檢測，來明確診斷。但是先證者及胞弟的腎臟病理缺乏典型的基底膜表現(xiàn)，Ⅳ型膠原染色提示無異常。Becknell 等［11］曾報(bào)道12 號外顯子c.665(T665G)突變導(dǎo)致Ⅳ型膠原染色正常但致典型AS 表型。為進(jìn)一步驗(yàn)證是否也存在本研究未發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)突變，并進(jìn)行了基因診斷。

二代測序是目前公認(rèn)的高通量高效的檢測手段［12］，本研究利用外顯子測序法結(jié)合sanger 法驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COL4A5 基因存在c.1365_1373del TCCAGGCCC 9 個堿基的缺失，導(dǎo)致21 號外顯子翻譯異常，通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)缺失的456 ～458位的3 個氨基酸PGP 正好位于2 個G-X-Y 中間(CEPGPPGPPGSPGDK)，使得GPPGPPGSP 序列變?yōu)镚PPGSP，即缺失了一個G-X-Y(GPP)的序列。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)在各物種間高度保守，說明其功能是至關(guān)重要的。已知Ⅳ型膠原是由α1-α6 6 條 肽 鏈 組 成 的 三 聚 體，α1α1α2，α3α4α5，和α5α5α6。其中COL4A5 和COL4A6 位于X 染色體，所有的基因編碼50 個外顯子，近1600個氨基酸，組成N 端7S 基序，C 端非膠原基序，中間為大的膠原基序，間插有22-26 個重復(fù)的Gly-X-Y序列。X 為脯氨酸或賴氨酸，Y 為羥脯氨酸或羥賴氨酸，這種特有的結(jié)構(gòu)參與形成了基底膜網(wǎng)絡(luò)［5，13-14］。當(dāng)COL4A5 基因突變時，由于缺乏正常結(jié)構(gòu)的α5 鏈，腎小球基膜α3α4α5 異三聚體組裝異常，α2α1α2 鏈代償增多［15］。增多的α2α1α2 鏈組成的膠原網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性和柔韌性差，電鏡下表現(xiàn)為基膜厚薄不一，花籃狀改變，基膜致密層的斷裂分層。針對Ⅳ型膠原NC1 區(qū)的免疫熒光染色可表現(xiàn)為免疫熒光染色完全或部分缺失。本家系中電鏡及免疫熒光表現(xiàn)不符合常見Alport 綜合征的表現(xiàn)，提示其可能存在不同常見位點(diǎn)突變所致的病理表現(xiàn)。進(jìn)一步基因測序研究證實(shí)為新的缺失突變。結(jié)合皮膚四型膠原ELSIA 法研究，未發(fā)現(xiàn)基底膜α5 鏈異常表達(dá)，說明該缺失不影響NC1 區(qū)蛋白表位，但卻極大影響了基膜網(wǎng)絡(luò)的功能。

根據(jù)歐洲、美國，德國及中國等5 個研究中心的研究數(shù)據(jù)［16-17］，Gross 等將COL4A5 基因突變位點(diǎn)與臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度分為3 類:嚴(yán)重型(S 型)、中度-重度嚴(yán)重型(M-S 型)、中度型(M 型)。S 型青少年期起病，年齡在20 歲以下，80%伴有聽力異常，40%伴有視覺異常，是由于大片段重組或提前終止翻譯或者移框突變或N 端序列突變等。M-S 型在26 歲前進(jìn)展至終末期腎病，腎外受累較少，主要基因異常在21-47 號外顯子區(qū)發(fā)生非甘氨酸錯義突變，甘氨酸替代突變，框內(nèi)或受體剪切位點(diǎn)突變等。M 型則在1-20 號外顯子，30 歲以后出現(xiàn)終末期腎病，70%的人有聽力喪失，最多30%眼睛受累，Bekheirnia 等［18］的研究也得到一致的結(jié)果，大部分進(jìn)行性進(jìn)展的AS 是由于截?cái)嗤蛔?、大或小缺失突變、或剪切突變所致。結(jié)合本家系，缺失位于21 號外顯子，腎外受累較少，表型為中等到嚴(yán)重程度(M-S)，與該分型描述一致，也說明本研究結(jié)果準(zhǔn)確，但突變方式為缺失，為首次報(bào)道已知基因新位點(diǎn)的突變。

根據(jù)Flinter 的AS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)［19］:①血尿/或慢性腎衰家族史;②電鏡下基底膜特征性改變;③眼前錐晶體或視網(wǎng)膜黃斑點(diǎn)狀改變;④進(jìn)行性耳感音神經(jīng)性耳聾，4 項(xiàng)中符合3 項(xiàng)即可臨床診斷。國內(nèi)目前認(rèn)為確診的方法［20］:①電鏡下典型病理改變;②皮膚基膜α5 鏈表達(dá)異常;③COL4A5/3/4 基因突變。根據(jù)本家系資料，認(rèn)為基因突變檢測是確診該疾病的最重要的最終手段，因?yàn)殡婄R結(jié)果或者基底膜α3、α5 鏈表達(dá)，是比較間接的結(jié)果，有可能引起漏診。結(jié)合Gross 等的分型與表型關(guān)系結(jié)果，M-S型腎外受累較少，或年幼兒聽力檢查存在局限性，F(xiàn)linter 的標(biāo)準(zhǔn)易導(dǎo)致臨床無法診斷。兒童腎科醫(yī)師需要提高認(rèn)識，必要時借助于基因檢測方法來確診，并有助于指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育。

總之，本研究利用基因測序法對一AS 家系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了新的COL4A5 基因1365_1373delTCCAGGCCC(p.Pro456_Pro458del3)膠原區(qū)缺失突變，截至2015 年4月為國內(nèi)外首次報(bào)道。臨床上可以用于AS 綜合征病變的檢測，疾病的分子診斷及產(chǎn)前診斷，豐富了目前COL4A5 的突變信息，為在此家系中開展疾病監(jiān)測起到重要作用。

［1］ Barker DF，Hostikka SL，Zhou J，et al.Identification of mutations in the COL4A5 collagen gene in Alport syndrome［J］.Science，1990，248(4960):1224-1227.

［2］ Antignac C，Knebelmann B，Drouot L，et al.Deletions in the COL4A5 collagen gene in X-linked Alport syndrome.Characterization of the pathological transcripts in nonrenal cells and correlation with disease expression［J］.J Clin Invest，1994，93(3):1195-1207.

［3］ 何 威，夏正坤，高春林.常見遺傳性腎小球疾病的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2015，28(3):308-312.

［4］ Maziers N，Dahan K，Pirson Y.From Alport syndrome to benign familial hematuria:clinical and genetic aspect［J］.Nephrol Ther，2005，1(2):90-100.

［5］ Hudson BG.The molecular basis of Goodpasture and Alport syndromes:Beacons for the discovery of the collagen Ⅳfamily［J］.J Am Soc Nephrol，2004，15(10):2514-2527.

［6］ Mochizuki T，Lemmink HH，Mariyama M，et al.Identification of mutations in theα3(Ⅳ)and α4(Ⅳ)collagen genes in autosomal recessive Alport syndrome［J］.Nat Genet，1994，8(1):77-81.

［7］ Hudson BG，Tryggvason K，Sundaramoorthy M，et al.Alport's syndrome，Goodpasture's syndrome，and type Ⅳcollagen［J］.N Engl J Med，2003，348(25):2543-2556.

［8］ Zhao C，Wang F，Zhang Y，et al.A novel splice site mutation in the COL4A5 gene in a Chinese female patient with rare ocular abnormalities［J］.Mol Vis，2012，18(8):2205-2212.

［9］ 高春林，馬上茹，夏正坤，等.兒童Gitelman 綜合征的SLC12A3 基因復(fù)雜雜合突變［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2015，28(1):37-40.

［10］ Alport AC.Hereditary familial congenital haemorrgagic nephritis［J］.BMJ，1927，1(3454):504-506.

［11］ Becknell B，Zender GA，Houston R，et al.Novel X-linked glomerulopathy associated with a COL4A5 missense mutation in a noncollagenous interruption［J］.Kidney Int，2011，79(1):120-127.

［12］ Chatterjee R，Hoffman M，Cliften P，et al.Targeted exome sequencing integrated with clinicopathological information reveals novel and rare mutations in atypical，suspected and unknown cases of alport syndrome or proteinuria［J］.PLoS One，2013，8(10):e76360.

［13］ Khoshnoodi J，Cartailler JP，Alvares K，et al.Molecular recognition in the assembly of collagens:Terminal noncollagenous domains are key recognition modules in the formation of triple helical protomers［J］.J Biol Chem，2006，281(50):38117-38121.

［14］ Posch E，Schlotzer-Schrehardt U，Brachvogel B，et al.CollagenⅣis essential for basement membrane stability but dispensable for initiation of its assembly during early development［J］.Development，2004，131(7):1619-1628.

［15］ Kashtan CE，Kim Y.Distribution of the α1 and α2 chains of collagen Ⅳand of collagens V and VI in Alport syndrome［J］.Kidney Int，1992，42(1):115-126.

［16］ Gross O，Netzer KO，Lambrecht R，et al.Meta-analysis of genotype-phenotype correlation in X-linked Alport syndrome:impact on clinical counseling［J］.Nephrol Dial Transplant，2002，17(7):1218-1227.

［17］ Jais JP，Knebelmann B，Giatras I，et al.X-linked Alport syndrome:natural history and genotype-phenotype correlations in girls and women belonging to 195 families:a"European Community Alport Syndrome Concerted Action" study［J］.J Am Soc Nephrol，2003，14(10):2603-2610.

［18］ Bekheirnia MR，Reed B，Gregory MC，et al.Genotype-phenotype correlation in X-linked Alport syndrome［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21(5):876-883.

［19］ Flinter FA，Cameron JS，Chantler C，et al.Genetics of classic Alport's syndrome［J］.Lancet，1988，2(8618):1005-1007.

［20］ 丁 潔.ALPORT 綜合征的診斷［J］.腎臟病與透析移植雜志，2010，19(4):344-345.