李建立，尹德云，王蘊(yùn)欣，龐鑫鑫，吳紅海，侯艷寧

0 引 言

最近動物研究表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的快速發(fā)育期連續(xù)大劑量應(yīng)用丙泊酚可引起發(fā)育期動物大腦廣泛腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的大量凋亡，甚至影響動物遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)記憶功能［1-2］。另外大量體外實驗研究表明丙泊酚可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元的凋亡［3-4］。目前針對丙泊酚的發(fā)育期神經(jīng)毒性已引起了眾多學(xué)者的廣泛關(guān)注，因此尋找安全有效的措施防治丙泊酚的發(fā)育期神經(jīng)毒性變得尤為迫切。研究表明17β 雌二醇作為一種內(nèi)源性神經(jīng)甾體，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能，具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，近年來17β 雌二醇的神經(jīng)保護(hù)作用已成為國內(nèi)外研究的熱點［5］。本研究觀察17β 雌二醇對丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響以及機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用17β 雌二醇預(yù)防丙泊酚發(fā)育期神經(jīng)毒性提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 丙泊酚(Diprivan，意大利AstraZeneca公司，批號:KW814)，20%脂肪乳購自廣州百特公司，DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、Neurobasal 培養(yǎng)液、B27 促生長劑購自美國Gibco 公司，17β 雌二醇、DMSO、MTT 購自美國Sigma 公司，羅丹明染料和胰蛋白酶購自北京索來寶公司，Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自浙江聯(lián)科生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取新生24 h 內(nèi)的SD幼鼠大腦額葉皮層組織，用冷PBS 洗劑，剪碎，移入0.125%胰蛋白酶中置于37 ℃水浴鍋內(nèi)充分消化15 min，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化，吸棄上清，然后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中用巴氏滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。然后經(jīng)100 目鋼絲篩過濾，計數(shù)后按1×109/L 的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)板中，放于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，全量換Neurobasal+B27 培養(yǎng)基，以后每隔2 天半量換液1 次。體外培養(yǎng)7 d 的神經(jīng)元用于實驗。

1.2.2 實驗分組 隨機(jī)分為對照組(給予相同體積的20%脂肪乳劑)，丙泊酚組(500 μmol/L 丙泊酚)，丙泊酚+17β 雌二醇組(500 μmol/L 丙泊酚，0.1 μmol/L 17β 雌二醇)。

1.2.3 光鏡顯微鏡下觀察不同藥物處理后皮層神經(jīng)元的形態(tài)變化 將細(xì)胞接種于6 孔板體外培養(yǎng)至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，在光鏡顯微鏡下觀察不同藥物處理后皮層神經(jīng)元的形態(tài)變化。

1.2.4 MTT 法檢測神經(jīng)元存活率 將細(xì)胞接種于96 孔板體外培養(yǎng)至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，移去培養(yǎng)液，每孔加入10 μL MTT 液，37 ℃孵育4 h，加入200 μL DMSO，輕輕振蕩溶解甲臜結(jié)晶，在多功能酶標(biāo)儀上測定570 nm 的吸光度值。以對照組平均吸收值為100%，以各處理組吸收值與對照組的比值計算細(xì)胞存活率。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元凋亡 將細(xì)胞接種于6 孔板體外培養(yǎng)至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，移去培養(yǎng)液，PBS 洗劑細(xì)胞3次，加入0.125%胰酶，消化的同時鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，胞體變圓時立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打混勻用PBS 重懸細(xì)胞并計數(shù)使每管細(xì)胞數(shù)目不少于1×106/mL 然后轉(zhuǎn)移到離心管中，1000 r/min 離心5 min(離心半徑6 cm)，去除上清，收集細(xì)胞。PBS 洗劑細(xì)胞2 次，1000 r/min 離心5 min(離心半徑6 cm)，去除上清，暗室中加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞然后加入10 μL PI 染色液，輕輕混勻，上機(jī)檢測各處理組神經(jīng)元的凋亡率。

1.2.6 羅丹明染色檢測皮層神經(jīng)元線粒體膜電位羅丹明123 可被線粒體吸收，線粒體通透性增加導(dǎo)致膜電位變化，羅丹明123 可被線粒體釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)羅丹明123 熒光強(qiáng)度改變。將細(xì)胞接種于6 孔板體外培養(yǎng)至7 d，按上述分組方法分別加入不同的藥物處理12 h，PBS 洗劑3 次，加入0.1 μg/mL 的羅丹明123 染液37 ℃孵育30 min。PBS 洗劑3 次后熒光顯微鏡下觀察拍片，用Image 軟件分析平均熒光強(qiáng)度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間兩兩比較采用SNK 法。以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對神經(jīng)元形態(tài)的影響 原代培養(yǎng)7 d的皮層神經(jīng)元經(jīng)不同藥物處理12 h 后光鏡下觀察，對照組神經(jīng)元胞體豐滿，突起較長，相互之間形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。與對照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元胞體立體感消失，顏色變暗，細(xì)胞輪廓不清，神經(jīng)元軸突斷裂，部分神經(jīng)元出現(xiàn)死亡。與丙泊酚組比較，丙泊酚+17β 雌二醇組神經(jīng)元形態(tài)變化明顯改善。見圖1。

圖1 不同處理對皮層神經(jīng)元形態(tài)的影響(×200)Figure 1 Morphology of the primarily cultured cortical neurons in the vehicle control(a)，propofol(b)，and propofol+17β-estradiol(c)groups(×200)

2.2 17β 雌二醇對丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷的影響 丙泊酚組神經(jīng)元存活率［(52.3±5.2)%］較對照組［(99.9±3.6)%］、丙泊酚+17β 雌二醇組［(90.1±7.2)%］均顯著下降(P ＜0.01)。見圖2。

圖2 不同處理對皮層神經(jīng)元存活率的影響Figure 2 Survival rate of the primarily cultured cortical neurons in the vehicle control，propofol，and propofol +17β-estradiol groups

2.3 17β 雌二醇對丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的影響 丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率［(43.4±4.6)%］較對照組［(3.1±0.2)%］、丙泊酚+17β 雌二醇組［(22.3±3.2)%］均顯著增高(P ＜0.01)。見圖3。

2.4 不同處理對皮層神經(jīng)元線粒體膜電位的影響丙泊酚組神經(jīng)元線粒體膜電位［(59.1±5.3)%］較對照組［(99.6±5.8)%］、丙泊酚+17β 雌二醇組［(89.2±7.1)%］顯著下降(P ＜0.01)。見圖4。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測各組皮層神經(jīng)元凋亡情況Figure 3 Apoptosis rate of the primarily cultured cortical neurons in the vehicle control (a)，propofol(b)，and propofol +17β-estradiol(c)groups

圖4 不同處理對皮層神經(jīng)元線粒體膜電位的影響(×200)Figure 4 Mitochondrial membrane potential of the primarily cultured cortical neurons in the vehicle control(a)，propofol(b)，and propofol+17β-estradiol(c)groups(×200)

3 討 論

本研究通過觀察17β 雌二醇對丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)17β 雌二醇改善了丙泊酚引起的神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，同時抑制了神經(jīng)元的凋亡，提高了神經(jīng)元的存活率，其機(jī)制可能是通過抑制丙泊酚引起的線粒體膜電位的下降作用實現(xiàn)的。

近年來研究表明丙泊酚對發(fā)育期大鼠大腦產(chǎn)生神經(jīng)毒性，引起廣泛腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡增加，并影響大鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶功能［1-2］。因此丙泊酚的臨床應(yīng)用，尤其是在嬰幼兒麻醉中的應(yīng)用，引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注［6］。針對麻醉藥引起的發(fā)育期大腦損傷，美國國立衛(wèi)生研究院、食品藥品監(jiān)督管理局以及國際麻醉研究學(xué)會要求研究者不僅要研究其發(fā)生機(jī)制，而且要尋找有效的措施來防治麻醉藥所引起發(fā)育期神經(jīng)損傷。以往研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定、乙酰左旋肉堿、鋰劑等可對丙泊酚引起的發(fā)育期神經(jīng)損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［7-9］。

17β 雌二醇作為一種內(nèi)源性神經(jīng)甾體，有研究表明17β 雌二醇具有促進(jìn)神經(jīng)元存活以及功能維護(hù)的作用［10］。目前學(xué)者對17β 雌二醇的神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行了一些研究，如對Aβ 神經(jīng)毒性、缺血缺氧性損傷、氧化應(yīng)激等產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用［11-12］。另外有研究表明17β 雌二醇可通過激活眾多促生存信號對γ 氨基丁酸A 型受體(Gamma amino acid type A receptor，GABAR)激動劑苯巴比妥以及N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)拮抗劑MK801 和氯胺酮引起的發(fā)育期大鼠大腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［13-14］。Lu 等［15］研究發(fā)現(xiàn)17β 雌二醇可通過激活PI3K-Akt 信號通路對麻醉藥異氟醚、一氧化氮、咪達(dá)唑侖的聯(lián)合應(yīng)用所引起的發(fā)育期大鼠大腦損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。乙醇作為一類古老麻醉藥，有研究發(fā)現(xiàn)17β 雌二醇可對乙醇引起的發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)損傷產(chǎn)生保護(hù)作用并改善大鼠成年后的行為學(xué)異常［16］。然而17β 雌二醇是否對丙泊酚所誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用以及機(jī)制目前還不清楚，本研究對此進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)17β 雌二醇可對丙泊酚誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用，保護(hù)線粒體膜電位可能是其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制之一。

目前研究表明丙泊酚誘導(dǎo)發(fā)育期大腦損傷與線粒體凋亡通路密切相關(guān)［17］。線粒體控制細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要依賴于兩方面:ATP 的持續(xù)產(chǎn)生以及線粒體膜電位的穩(wěn)定，線粒體膜電位的維持是線粒體功能正常發(fā)揮的前提條件。當(dāng)線粒體呼吸鏈?zhǔn)艿揭种茣r，膜電位發(fā)生變化進(jìn)而釋放細(xì)胞色素C 以及其他凋亡誘導(dǎo)因子，引起一系列凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。線粒體功能受抑主要表現(xiàn)為膜電位的下降，膜電位下降是細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期事件，早于細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)以前，線粒體膜電位一旦不能維持，凋亡發(fā)生就不可逆轉(zhuǎn)［18］。有研究表明抑制線粒體膜電位的下降可阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生［19］。本研究結(jié)果顯示丙泊酚導(dǎo)致原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡與線粒體膜電位的下降有關(guān)。17β 雌二醇通過抑制丙泊酚引起的神經(jīng)元線粒體膜電位下降對丙泊酚誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生保護(hù)作用。

總之17β 雌二醇具有保護(hù)神經(jīng)元免受丙泊酚損傷的作用，其機(jī)制是通過抑制丙泊酚引起的線粒體膜電位的下降作用實現(xiàn)的。本研究為圍術(shù)期應(yīng)用17β 雌二醇預(yù)防丙泊酚對嬰幼兒大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷提供了初步的實驗依據(jù)。

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