王 辛，馬 茜，李丹丹，王愛紅

0 引 言

腦卒中具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點，其中，缺血性卒中約占85%［1］，多由大腦中動脈阻塞所致。近年來，隨著對缺血后繼發(fā)性腦損傷機(jī)制的深入研究，免疫炎癥反應(yīng)已受到廣泛關(guān)注。脾作為外周免疫調(diào)節(jié)的蓄水池，腦缺血后，相關(guān)炎性標(biāo)記物(炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子等)應(yīng)激性的表達(dá)增加，不僅作用于脾組織，也可經(jīng)血液循環(huán)，在缺血區(qū)募集活化，加重腦損傷［2］。越來越多的研究表明，脾在卒中后腦損傷的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但是，兩者間是否具有潛在聯(lián)系，目前報道不多。本研究通過建立永久性大腦中動脈閉塞(permanent occlusion of the middle cerebral artery，pMCAO)模型，動態(tài)觀察脾質(zhì)量指數(shù)與神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積的變化規(guī)律，探討其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF 級健康雄性SD 大鼠30 只，體重為(300±20)g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供［許可證號:SCXK(京)2012-0001］。大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食、飲水、飼養(yǎng)環(huán)境溫度19 ～26 ℃，濕度40%～70%，通風(fēng)良好，自然晝夜節(jié)律光照。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組(頸部切開，鈍性分離大鼠右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈后即縫合，不做進(jìn)一步手術(shù)處理)、缺血3 d 組和缺血7 d 組(應(yīng)用線栓法制成大鼠pMCAO模型)，每組10 只。

1.2 實驗試劑和儀器 氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltet razolium chloride，TTC，美國Sigma 公司);電子天平(上海浦春計量儀器有限公司);大腦中動脈阻塞線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司);腦切片模具(深圳瑞沃德生命科技有限公司);恒溫隔水培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司);Histostar包埋機(jī)、Finesse E+手動切片機(jī)(美國Thermo 公司);BX41 顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 pMCAO 大鼠模型的制備 術(shù)前禁食12 h后，根據(jù)改良線栓法［3］阻塞大鼠右側(cè)大腦中動脈制備永久性腦缺血模型。具體步驟:①10%(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定大鼠;②頸部正中備皮消毒后，行(30 ～40)mm縱向切口，鈍性分離各層肌肉和筋膜后，暴露頸動脈三角，分離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，避免損傷迷走神經(jīng);③手術(shù)線結(jié)扎CCA 和ECA 的遠(yuǎn)心端，在ICA近心端掛線、系活結(jié)后，用微動脈夾暫時阻斷ICA血流;④在距CCA 分叉處上端約3 mm 處剪小口，將直徑0.28 mm 的線栓插入CCA 后系緊活結(jié)，松微動脈夾，繼續(xù)將線栓由CCA 經(jīng)ICA 緩慢推至大腦中動脈，深度約18 ～20 mm，遇阻力即停止插線，注意避免插入翼腭動脈;⑤剪去暴露在血管外的剩余線栓后，逐層縫合皮下組織及皮膚。造模過程中注意保溫，室溫維持在25 ℃。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評分 采用Zea-longa［4］評分法，于大鼠造模清醒時、缺血3 d 和7 d 時間點分別進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。0 分:無神經(jīng)缺損癥狀;1分:無法完全伸展左側(cè)前肢;2 分:行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3 分:行走時向左側(cè)傾倒;4 分:不能自發(fā)行走，痙攣、昏睡、意識喪失。術(shù)后清醒時評分在1 ～3 分表示造模成功;0 分和4 分表示造模失敗，剔除。

1.3.3 脾質(zhì)量指數(shù)的檢測 腦缺血后3 d 和7 d，稱取大鼠體重，無菌條件下在動物左下腹部切約30×40 mm 的切口，迅速取脾，去除表面脂肪和筋膜，用預(yù)冷的等滲鹽水沖凈，濾紙吸干后稱重、記錄脾質(zhì)量，計算脾質(zhì)量指數(shù)。計算公式:

脾質(zhì)量指數(shù)=脾質(zhì)量/體重(mg/g)

1.3.4 腦梗死病灶體積測定 腦缺血后3 d 和7 d，行神經(jīng)功能缺損評分后，大鼠斷頭取腦，等滲鹽水沖凈，放入-20 ℃冰凍20 min，取出置于大鼠腦模具中，自視交叉水平做等距離連續(xù)5 片的冠狀切片(片厚2 mm)。將切片放于37 ℃1%TTC 溶液中，避光孵育30 min，為保證腦片染色均勻，每隔10 min翻動一次。染色后腦片置于4%多聚甲醛中固定24 h，拍照，利用Image-Pro Plus 5.0 圖像處理軟件計算每張切片患側(cè)腦梗死面積和對側(cè)全腦面積。計算公式［5］:

腦梗死體積百分比(%)=患側(cè)梗死面積/對側(cè)全腦面積×100%

1.3.5 腦組織病理學(xué)檢查 腦缺血后3 d 和7 d，各組隨機(jī)取4 只大鼠，4%多聚甲醛行心臟灌注后，迅速斷頭取腦。分離大腦皮質(zhì)，置于4%的多聚甲醛中固定24 h 后石蠟包埋，制成厚4 μm 石蠟切片，行HE 染色，光化學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，2 組間均數(shù)比較采用t 檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析(One-way ANOVA);非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)M(P25，P75)表示，2 組間比較采用Wilcoxon 非參數(shù)檢驗。相關(guān)性分析時，符合正態(tài)分布時用偏相關(guān)系數(shù)描述，不符合正態(tài)分布時用Spearman 相關(guān)系數(shù)描述。以P≤0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠脾質(zhì)量指數(shù)的比較 與假手術(shù)組、缺血7 d 組脾質(zhì)量指數(shù)［(1.90±0.22)mg/g、(1.62±0.58)mg/g］比較，缺血3 d 組［(0.87±0.59)mg/g］明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖1。

圖1 各組大鼠脾質(zhì)量指數(shù)的比較Figure 1 Comparison of the spleen mass index among the three groups of rats

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較 假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀。大鼠術(shù)后清醒時，缺血3 d組和缺血7 d 組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);術(shù)后相應(yīng)時點，缺血7 d 組神經(jīng)功能缺損評分較缺血3 d 組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠腦梗死體積比較 TTC 染色顯示正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)為白色。假手術(shù)組腦組織均為紅色，無梗死灶;缺血3 d 組和缺血7 d 組梗死明顯，且多位于大腦皮層、紋狀體等部位。與缺血7 d 組腦梗死體積比較，缺血3 d 組增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較Table 1 Comparison of neurological dysfunction scores among the three groups of rats

2.4 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變 假手術(shù)組大腦實質(zhì)各層結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細(xì)胞未見腫脹、空泡變性，核正常，血管未見出血及淋巴細(xì)胞聚集的現(xiàn)象。與缺血7 d 組比較，缺血3 d 組大腦皮層和海馬內(nèi)出現(xiàn)大量神經(jīng)元壞死，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細(xì)胞核顯著固縮，胞體縮小變形，間質(zhì)水腫，血管周間隙明顯增寬，見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織病理變化(HE ×200)Figure 2 Pathological changes in the brain tissues of the three groups of rats(HE ×200)

2.5 大鼠脾質(zhì)量指數(shù)與神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積百分比的相關(guān)性 相關(guān)分析顯示，脾質(zhì)量指數(shù)與神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積百分比呈負(fù)相關(guān)(r=-0.851，P=0.019;r=-0.717，P=0.013)。

3 討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后所造成的腦組織損害以及血-腦屏障的破壞，可能引起機(jī)體免疫功能失衡［6］。脾作為機(jī)體“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，是免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等)和細(xì)胞因子(趨化因子、補體等)定居的主要場所。腦損傷早期，中樞通過交感神經(jīng)系統(tǒng)分泌的兒茶酚胺與脾α、β 腎上腺素受體結(jié)合，導(dǎo)致脾宿主細(xì)胞凋亡，脾萎縮［7］。既往研究發(fā)現(xiàn)，脾切除術(shù)可以顯著減小腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損癥狀［8-9］。因此，維持脾的正常生理功能，對于緩解卒中后腦損傷具有積極意義。大量研究表明，脾形態(tài)與脾功能密切相關(guān)［10-13］，且由于脾血流量豐富，其早期病變多表現(xiàn)為脾體積的改變［14］，故本研究進(jìn)一步將脾體積作為判斷其生理功能的外在標(biāo)志。

大量研究表明，腦損傷后外周免疫功能的改變具有時間依賴性，多以缺血3 d 最明顯，且持續(xù)時間長達(dá)數(shù)周［15-16］，故本研究選擇缺血3、7 d 時間點進(jìn)行觀測。與假手術(shù)組比較，缺血3 d 組大鼠脾質(zhì)量指數(shù)明顯下降(P ＜0.01)，這說明腦缺血后，外周脾免疫功能遭到破壞，最終導(dǎo)致脾萎縮的發(fā)生，這與以往研究結(jié)果一致［17］。同時，Gendron 等［18］指出，腦缺血7 d 時，中樞分泌的去甲腎上腺素水平降低，對脾正常生理功能的拮抗作用減弱，這可能是本實驗中缺血7 d 組脾質(zhì)量指數(shù)下降不明顯的原因之一。

神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積不僅是判斷腦缺血模型造模成功的金標(biāo)準(zhǔn)，也是腦損傷后神經(jīng)功能康復(fù)的關(guān)鍵［19］。本研究通過建立接近臨床腦缺血患者的pMCAO 大鼠模型［20］，觀察發(fā)現(xiàn)，缺血3 d組和缺血7 d 組均呈現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀、腦組織梗死灶明顯，證明了本模型的成功復(fù)制。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)具有時間依賴性，通過建立局灶性腦缺血小鼠模型發(fā)現(xiàn)［21］，Longa 神經(jīng)功能缺損評分在1、4、7 d 呈下降的趨勢;在腦缺血再灌注大鼠模型中也發(fā)現(xiàn)［22］，神經(jīng)功能評分隨著時間的延長逐漸改善。本實驗結(jié)果亦顯示，與缺血3 d 組比較，缺血7 d 組大鼠神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積有好轉(zhuǎn)傾向(P ＜0.05)。分析導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是:①大鼠的神經(jīng)結(jié)構(gòu)更為原始，具有較強的再生修復(fù)能力;②缺血7 d 時，大鼠腦血管側(cè)枝循環(huán)重塑，梗死側(cè)腦組織實現(xiàn)腦血流再通。

腦血流量灌注不足、能量代謝障礙等病理生理改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞不可逆性壞死和神經(jīng)功能受損［23-24］，這已成為缺血性腦損傷發(fā)展變化的核心以及影響預(yù)后的主要因素。不同時點動物模型均呈現(xiàn)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的壞死、細(xì)胞核固縮和間質(zhì)水腫等病理改變，且缺血3 d 組較缺血7 d 組損傷明顯。

以神經(jīng)功能缺損評分和腦梗死體積百分比作為分層因素，分析發(fā)現(xiàn)脾質(zhì)量指數(shù)越低，神經(jīng)功能缺損癥狀越嚴(yán)重，腦梗死體積越大，提示脾質(zhì)量指數(shù)可能反映缺血性腦損傷的嚴(yán)重程度，這恰好反映了脾生理功能與腦損傷間的潛在聯(lián)系，故對于腦缺血后脾體積的變化需提高重視。

綜上所述，本研究通過將脾體積作為判斷脾生理功能演變的外在標(biāo)志，初步證實了腦缺血后，外周脾與中樞腦損傷的關(guān)系，這將為臨床通過脾的靶向治療促進(jìn)腦缺血患者神經(jīng)功能的康復(fù)提供了理論依據(jù)，但針對脾與腦損傷后相互作用的內(nèi)在分子機(jī)制的研究仍需進(jìn)一步深入探討。

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