嚴強，古月

內(nèi)江市市中區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,四川內(nèi)江 641000

血小板(Platelet,PLT)參與了人體凝血和止血效應，具有重要的生理學作用。血小板計數(shù)是判斷凝血功能的重要指標。血小板減少是引起患者出血時間延長的重要原因之一，患者在嚴重損傷或在激狀態(tài)可發(fā)生出血。假性血小板減少(pseudothrombocytopenia，PTCP）是由于各種原因引起的血小板聚集導致儀器計數(shù)血小板減少的假象。EDTA鹽抗凝劑是導致血常規(guī)分析血小板計數(shù)假性降低的主要原因,并建議改用枸櫞酸鈉抗凝劑重新采集患者血液標本進行血小板計數(shù)[1-2]。最近報道，枸櫞酸鹽同樣可以導致離體后的血液標本中血小板假性降低，并且隨著時間的延長，血小板計數(shù)降低得更明顯[3-4]。該研究采用血液分析儀稀釋法和肝素抗凝劑法對41例EDTA依賴性假性血小板降低的血液標本血小板檢測方法進行比較研究，旨在找出針對該類標本最適宜的血小板計數(shù)方法，避免因血小板假性降低導致的臨床誤診或漏診。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2014年7月—2015年7月在日常的檢驗工作中發(fā)現(xiàn)的EDTA依賴性血小板降低的門診及住院患者共41例，其中男性 21例，女性 20例。

1.2 儀器與試劑

儀器為日本SYSMEX KX-21自動分析儀，試劑為均為儀器配套原裝試劑，真空采血管采用成都瑞琦科技實業(yè)有限責任公司生產(chǎn)的 EDTA-K2抗凝采血管和枸櫞酸鈉抗凝采血管。

1.3 研究方法

1.3.1 儀器全血法 采集患者外周靜脈血，注入EDTAK2抗凝的真空采血管，立即充分混勻后，嚴格按照儀器操作規(guī)程，在不同時間點(0～5 min、15 min、30 min、1 h、2 h)進行血小板計數(shù)。

1.3.2 儀器稀釋法 將EDTA-K2抗凝全血充分混勻后作26倍稀釋，即取20μL全血加入到500μL稀釋液中，充分混勻后在不同時間點(0～5 min、15 min30 min、1 h、2 h)，應用KX-21自動血液分析儀進行血小板測定。

1.3.3 枸櫞酸鈉抗凝劑法 對納入的研究對象，重新抽血外周靜脈血注入枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管，立即充分混勻后，嚴格按照儀器操作規(guī)程，在不同時間點(0～5 min、15 min、30 min、1 h、2 h)在KX-21 自動血液分析儀上進行血小板計數(shù)。

1.3.4 手工法 以草酸銨作為抗凝劑，采用手工法進行計數(shù)。嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4版進行操作[5]。具體操作方法為:采患者指血20μL置于380μL草酸銨稀釋液中，充分混勻后在顯微鏡下計數(shù)。每份標本計數(shù)2次，取平均值。 同時，對每份血液標本采用瑞氏染色法進行血涂片染色，干燥后在顯微鏡下觀察血小板分布情況。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析，計量資料以平均值±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料用率（%）表示，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 41例EDTA依賴性血小板降低的原因分析

對出現(xiàn)EDTA依賴性血小板降低的標本進行分析發(fā)現(xiàn)，導致該現(xiàn)象發(fā)生的具體原因包括血小板聚集、血小板衛(wèi)星現(xiàn)象、采血不通暢、抗凝劑不足和抗凝劑過量，發(fā)生率分別為51.2%、2.4%、22.0%、9.8%和14.6%，見表1。

表1 41例EDTA依賴性血小板降低的原因分析

2.2 不同方法測定假性血小板降低的患者標本檢測結果

以手工法為判斷標準，在不同時間點分別用KX-21全血法、KX-21稀釋法和枸櫞酸鈉抗凝法對患者血小板進行測定，結果如表2所示。采血后0～5 min各種測定方法與手工法比較，血小板測定結果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而15 min后，KX-21儀器法與手工法比較，血小板測定結果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。稀釋法在2 h內(nèi)與手工法測定結果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。枸櫞酸鹽抗凝法在1 h后與手工法比較，血小板測定結果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 不同方法對假性血小板降低患者標本的測定結果比較（±s）

表2 不同方法對假性血小板降低患者標本的測定結果比較（±s）

注：△與手工法比較，P＞0.05；▲與手工法比較，P＜0.05。

測定時間KX-21全血法KX-21稀釋法 枸櫞酸鈉抗凝法 手工法0～5 min 15 min 30 min 1 h 2 h（231±32）△（79±26）▲（48±19）▲（21±6）▲（20±5）▲（228±29）△（225±30）△（221±33）△（226±35）△（231±36）△（223±23）△（226±21）△（169±17）△（101±14）▲（68±12）▲223±24 220±26 230±35 226±26 217±22

3 討論

血小板假性降低與多種疾病密切相關，往往伴發(fā)于外科手術、創(chuàng)傷、燒傷、膿毒血癥、腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、傳染性單核細胞增多癥等。腫瘤患者長期使用化療或放療，不僅對造血系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，而且會引起血小板結構和功能的改變。血液系統(tǒng)疾病如白血病等會嚴重影響造血功能，血小板不經(jīng)數(shù)量減少，而且形態(tài)結構和功能也發(fā)生實質(zhì)性改變，容易發(fā)生EDTA依賴性血小板降低。兒科患者主要是由于采血不通暢，采血過程中血小板聚集和粘附性改變，EDTA鹽進一步與血小板發(fā)生相互作用，聚集和凝集更為明顯。

目前認為，血小板假性降低主要與EDTA鹽抗凝劑有關[6-7]。PTCP的發(fā)生可能與EDTA鹽抗凝劑導致血小板活化過程有關，活化的血小板與存在于人體血液中的自身抗體結合，導致血小板形態(tài)結構發(fā)生改變，導致血小板膜表面的某種隱匿性抗原表位構象的改變，從而促進和加速了血小板與血漿中的纖維蛋白原聚集。此外，還可能與患者血液存在冷抗血小板的自身抗體有關[8]。這種EDTA依賴性冷抗血小板自身抗體直接作用于血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，而糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板膜上最重要的糖蛋白，參與血小板的黏附、聚集反應[9]。與血小板結合的自身抗體Fc段可與單核細胞或淋巴細胞的Fc受體結合，出現(xiàn)血小板衛(wèi)星現(xiàn)象[10]。

該研究通過對出現(xiàn)EDTA依賴性血小板降低的標本進行研究分析發(fā)現(xiàn)，導致該現(xiàn)象發(fā)生的具體原因主要包括血小板聚集、血小板衛(wèi)星現(xiàn)象、采血不通暢、抗凝劑不足和抗凝劑過量，發(fā)生率分別為51.2%、2.4%、22.0%、9.8%和14.6%。這提示血小板聚集可能是發(fā)生EDTA依賴性血小板降低的主要機制。

目前，關于EDTA引起的假性血小板降低的校正方法，已報道的方法主要有3種，即直接手工計數(shù)、更換抗凝劑和即刻全血計數(shù)法[11-13]。以手工法為判斷標準，在不同時間點分別用KX-21全血法、KX-21稀釋法和枸櫞酸鈉抗凝法對患者PLT進行測定，結果如表2所示。采血后0～5 min各種測定方法與手工法比較，血小板測定結果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而15 min后，KX-21儀器法與手工法比較，血小板測定結果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。稀釋法在2 h內(nèi)與手工法測定結果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。枸櫞酸鹽抗凝法在1 h后與手工法比較，血小板測定結果差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。枸櫞酸鹽抗凝劑計數(shù)血小板，在采血后短時間內(nèi)不會引起血小板降低，而隨著時間的延長，血小板計數(shù)也會隨之下降。而血液分析儀稀釋法是一種較為理想的校正方法，測定速度快，可實現(xiàn)自動化檢測，準確度與手工計數(shù)法接近。與文獻報道相符[14]。

綜上可知，EDTA依賴性血小板降低發(fā)生的原因主要包括血小板聚集、血小板衛(wèi)星現(xiàn)象、采血不通暢、抗凝劑不足和抗凝劑過量。當儀器出現(xiàn)與臨床診斷嚴重不符的血小板異常降低時，應及時分析原因，通過更換抗凝劑種類、適當控制標本放置時間，采取儀器稀釋法，或通過手工計數(shù)和血涂片染色觀察可有效區(qū)分真性與假血小板計數(shù)降低，從而提高檢測結果的準確度。血液分析儀稀釋法是一種較為理想的校正方法，用于臨床實驗室。

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