胡云　徐如宏

摘 要：應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)4份來(lái)自美國(guó)的小麥研究材料的高蛋白含量基因GPC-B1進(jìn)行分子標(biāo)記分析。通過引物篩選和標(biāo)記研究，其SSR分子標(biāo)記為Xuhw89122 。為鑒定其分子標(biāo)記分析結(jié)果，對(duì)所有的小麥研究材料進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，來(lái)自美國(guó)的4份研究材料之一的PI638740的蛋白質(zhì)含量高達(dá)20.41%，明顯高于其他研究材料。田間觀察結(jié)果顯示，PI638740的成熟期比別的研究材料提前衰老一周左右。本研究將為轉(zhuǎn)移控制小麥高蛋白質(zhì)含量的基因到其他優(yōu)良小麥品種（品系）中、推進(jìn)小麥育種進(jìn)程及改進(jìn)小麥育種技術(shù)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥；高蛋白基因；分子標(biāo)記；蛋白質(zhì)含量

中圖分類號(hào)： S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.09.002

Abstract：The high protein content gene GPC-B1 was marked by SSR markers in four high protein wheat from America. The GPC gene was on the short arm of chromosome 6B from Triticum turgidum ssp.dicoccoides. Its SSR markers was Xuhw89122 .The protein of PI638740 content was tested for 20.41%. Obviously， the protein content of one of the four materials was highest. The results in field showed that it matured more previously round a week compared with the only other wheat. The markers acquired would offer an effective elected means to transfer the high protein gene to other wheat materials.

Key words：wheat； high protein gene； molecularm markers； protein content

大量的信息顯示，在小麥育種和生產(chǎn)上世界各國(guó)都經(jīng)歷了從重視產(chǎn)量到產(chǎn)量和質(zhì)量并重的過程。在中國(guó)，小麥品質(zhì)育種起步較晚，而在國(guó)外很早就開始了。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，中國(guó)許多育種單位把小麥的主要育種目標(biāo)定為質(zhì)量改進(jìn)及小麥品質(zhì)性狀的遺傳[1-3]。自“七五”以來(lái)，國(guó)家科技攻關(guān)計(jì)劃已經(jīng)包括了小麥品質(zhì)育種。

當(dāng)今小麥育種工作的重點(diǎn)是小麥品質(zhì)改良，小麥改良的基礎(chǔ)是遺傳多樣性，分子標(biāo)記為遺傳多樣性研究的最理想的標(biāo)記。很多學(xué)者采用形態(tài)學(xué)性狀、蛋白電泳、RFLP和RAPD等來(lái)評(píng)價(jià)小麥遺傳多樣性，其中分子標(biāo)記被認(rèn)為是研究遺傳多樣性的最理想標(biāo)記[4-5]。很多學(xué)者利用形態(tài)性狀、蛋白質(zhì)電泳、RFLP和RAPD等對(duì)普通小麥的遺傳多樣性作過評(píng)價(jià)。

在野生二粒小麥中找到一個(gè)基因GPC（Grain protein content），可以提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的潛在資源，并成功地克隆、轉(zhuǎn)入多個(gè)現(xiàn)有小麥品種中。GPC基因來(lái)源于以色列野生二粒小麥基因型FA15-3，被定位于染色體6BS。后來(lái)，又從同一野生二粒小麥即FA15-3中發(fā)現(xiàn)了抗條銹病基因Yr36，該基因位于6BS染色體上，研究表明該抗條銹病基因與高蛋白基因GPC-B1緊密連鎖。Olmos等將此基因位點(diǎn)（QTL的數(shù)量，數(shù)量性狀位點(diǎn)）作為一個(gè)單基因孟德爾位點(diǎn)，命名為GPC-B1，限定于2.7 cM的遺傳距離之間[6-11]。Distelfelt等進(jìn)一步將GPC-B1區(qū)域限制在0.3 cM之內(nèi)[12]。Uauy等利用兩個(gè)Marker Xuhw89和Xuhw71標(biāo)記出250 kb的DNA片段，其中包含GPC-B1[13-14]。2007年，高效遺傳圖譜將基因GPC-B1限制在一個(gè)7.4 kb的區(qū)域，并且還發(fā)現(xiàn)這個(gè)區(qū)域包含著一個(gè)可以用來(lái)編碼轉(zhuǎn)錄因子的單基因[15]。通過對(duì)GPC-B1轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因小麥的大量觀察，7.4 kb區(qū)域的存在與其表現(xiàn)型的差異關(guān)系密切，這表明GPC-B1基因是一個(gè)具有多重效應(yīng)的基因。

另外，還發(fā)現(xiàn)了含有高蛋白質(zhì)含量基因GPC-B1的小麥比一般小麥的衰老期平均提前4～5 d，而且小麥籽粒中的蛋白質(zhì)含量及Fe、Zn微量元素含量增加了10%～15%[16-18]。以上研究表明：轉(zhuǎn)基因小麥成熟期有所縮短，養(yǎng)分逐漸向成熟種子轉(zhuǎn)移，使養(yǎng)分得到了再利用。

關(guān)于小麥蛋白質(zhì)含量研究的文章大多集中在HWM-GS方面，而從控制高蛋白含量基因方面研究的文章卻很少見報(bào)道。本研究目的就是利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記研究小麥高蛋白基因GPC-B1，以期促進(jìn)該基因在小麥育種中的應(yīng)用，對(duì)輔助小麥高蛋白含量的育種，提高選擇效率都有所裨益。

1 材料和方法

1.1 材 料

4份小麥高蛋白材料分別為A-GPC，R-GPC，PF638741，PI638740。另外，還有龍96-6239×貴農(nóng)105/775F2 （后稱X—2003），貴農(nóng)775，貴農(nóng)5號(hào)，貴農(nóng)21和萊州137等10個(gè)貴州當(dāng)?shù)匦←?。pm21為抗白粉病基因，其中貴農(nóng)775就含有此基因[19-20]。以4份高蛋白含量材料作為父本，分別與貴農(nóng)775配置雜交組合，其雜種F1自交得到F2植株，從F1和F2中分別選取100個(gè)單株進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，其余材料作為對(duì)照。4份高蛋白材料引自以色列，其余材料來(lái)自貴州大學(xué)麥作研究中心。

1.2 小麥籽粒蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

按照ICC標(biāo)準(zhǔn)，NO，116，NO，118（NIR），然后用Foss kjeltecTM2200型全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定，測(cè)量6次并取平均值。

1.3 小麥總DNA的提取

親本材料、雜種F1代及F2100個(gè)單株葉片總DNA的提取。參照Devos的酚-氯仿提取法提取葉片DNA，略有修改[21]。適于1.5 mL離心管提取。取0.2 g的新鮮幼嫩葉片放入研缽中，加入750 μL的提取緩沖液（100 mmol·L-1 Tris-HCl，50 mmol·L-1 EDTA-Na2，2.0%CTAB，100 mmol·L-1 NaCl）磨碎后轉(zhuǎn)至1.5 mL的離心管內(nèi)，65 ℃下水浴1 h。在此期間上下顛倒2次，然后加入相同體積的24∶1的氯仿-異戊醇，顛倒混勻10 min，置于18 ℃的冰凍離心機(jī)內(nèi)，13 000 r·min-1，離心10 min。然后取上清液，放入1.5 mL離心管中，加入750 μL異丙醇，上下緩慢顛倒混勻，13 000 r·min-1離心10 min。去上清液，用1 mL 70%乙醇清洗DNA沉淀，室溫下放置5～10 min，7 500 r·min-1離心5 min，去上清液，干燥。加入0.1TE100 μL 混勻，37 ℃下水浴1 h；取總DNA提取液2 μL，用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)，了解總DNA的純度和濃度。

1.4 PCR 擴(kuò)增

在Perkin-Thermocycle 480上進(jìn)行特征PCR反應(yīng)，其反應(yīng)總體積為20 μL。SSR標(biāo)記反應(yīng)體系中含有50 mmol·L-1 KCl，10 mmol·L-1 Tris-HCl（PH8.8），2.0 mmol·L-1 MgCl2，50～100 ngDNA模板，特異引物0.5 μmol·L-1，100 μmol·L-1 Dntp，1 U Taq DNA聚合酶，定容至20 μL。加少量礦物油覆蓋后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，再循環(huán)37次， 72 ℃延伸5 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，加溴化乙錠0.5 μg·mL-1，電壓為7 V·cm-1，1×TAE電泳緩沖液，紫外光觀察并照相。與高蛋白基因GPC-B1連鎖的特異引物為Xuhw89，其序列為：UHW89-BF 5'- TCT CCA AGA GGG GAG AGA CA -3'，UHW89-R 5'- TTC CTC TAC CCA TGA ATC TAG CA -3'。特異引物UHW89-BF及UHW89-R擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記為SSR122。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

根據(jù)C Uauy等[5]野生二粒小麥（Triticum turgidum ssp.disossoides）6BS染色體上抗條銹病基因Yr36、小麥高蛋白含量基因GPC的遺傳圖譜，初步篩選兩個(gè)基因連鎖的引物，見表1。

應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)篩選與GPC-B1基因連鎖的引物（表1），設(shè)置多個(gè)重復(fù)，引物為Xuhw89122標(biāo)記的結(jié)果重復(fù)性較好，擴(kuò)增結(jié)果見圖1。上述12對(duì)引物中，在122 bp的位置能擴(kuò)增出特征DNA片段的只有引物Xuhw89。另外Xgwm508引物在170 bp位置也能擴(kuò)增出特征帶，但是該引物性狀很不穩(wěn)定，有時(shí)不能顯示特征帶，如圖1所示。圖1中6～10為4份高蛋白材料，其中5、6為研究材料A-GPC。

2.2 小麥蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

對(duì)4份小麥高蛋白質(zhì)含量的材料、11個(gè)貴州當(dāng)?shù)匦←湶牧嫌梦⒘縿P氏定氮法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量（表2）。4份小麥高蛋白材料中，有1份材料的蛋白質(zhì)含量明顯比其他材料高，其余3個(gè)小麥高蛋白材料的蛋白質(zhì)含量卻比部分貴州當(dāng)?shù)夭牧系停F州當(dāng)?shù)氐男←湶牧现械鞍踪|(zhì)含量都不高。綜合來(lái)看可能是由于地理、氣候、土壤、水分等多方面因素所致，使其目標(biāo)性狀得不到表達(dá)。但分子標(biāo)記的結(jié)果顯示，4份小麥高蛋白材料都含有高蛋白質(zhì)含量基因GPC，這說(shuō)明分子標(biāo)記鑒定結(jié)果仍然存在著局限性，分子標(biāo)記技術(shù)分析對(duì)基因是否表達(dá)提供不了任何可靠的依據(jù)，還需采用其他方法測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，以進(jìn)一步驗(yàn)證分子標(biāo)記的結(jié)果。

2.3 小麥高蛋白含量基因GPC-B1的SSR標(biāo)記

對(duì)4份高蛋白材料A-GPC，R-GPC，PF638741，PI638740，以及龍96-6239×貴農(nóng)105/775F2，對(duì)照材料萊州137、貴農(nóng)5號(hào)進(jìn)行SSR標(biāo)記（圖2）。從圖2中可以看出，引物Xuhw89 在122 bp位置附近標(biāo)記出了4個(gè)小麥高蛋白材料，都出現(xiàn)了一條特征帶。而蛋白含量不高的兩個(gè)對(duì)照材料萊州137和貴農(nóng)5號(hào)在同一位置都不具有此特征帶。對(duì)PI638740×貴農(nóng)775的F1、F2 的100個(gè)單株進(jìn)行高蛋白質(zhì)含量基因GPC-B1的篩選，結(jié)果表明，4份小麥高蛋白材料中都含有控制蛋白質(zhì)含量較高的目標(biāo)基因GPC-B1，而對(duì)照材料中均沒有。雜交F1也能擴(kuò)增出122 bp的特征帶（圖3），F(xiàn)2單株群體的高蛋白基因呈現(xiàn)3∶1的比例，說(shuō)明高蛋白材料中高蛋白基因是受顯性單基因控制的。

為檢測(cè)引物Xuhw89的穩(wěn)定性和與高蛋白基因連鎖的關(guān)系，對(duì)PI638740與貴農(nóng)775雜交F2單株群體共100個(gè)植株進(jìn)行SSR擴(kuò)增分析（圖4）。結(jié)果表明，引物Xuhw89122 擴(kuò)增帶是與上述4份高蛋白含量材料中的高蛋白基因GPC-B1連鎖的。在100株單株中，顯示有73株具有特征帶，27株無(wú)特征帶，接近3∶1。

3 結(jié)論與討論

在本研究中，為篩選出能標(biāo)記高蛋白基因GPC-B1的引物，根據(jù)大量資料挑選了12對(duì)引物，經(jīng)篩選最后確定了引物Xuhw89的穩(wěn)定性是最好的。通過對(duì)4份小麥高蛋白材料及另10份貴州當(dāng)?shù)匦←溸M(jìn)行目標(biāo)性狀分子標(biāo)記檢測(cè)，證明了4份高蛋白材料含有目標(biāo)基因GPC-B1，其余研究材料中并不存在此基因。同時(shí)利用微量凱氏定氮法進(jìn)一步驗(yàn)證其蛋白質(zhì)含量，其中研究材料PI638740的蛋白質(zhì)含量高達(dá)20.41%。其余研究材料即10份貴州當(dāng)?shù)匦←湹牡鞍踪|(zhì)含量在14%～16%之間的較多，能達(dá)到18%以上有一兩個(gè)。4個(gè)小麥高蛋白材料中除PI638740外，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定，其余3個(gè)材料的蛋白質(zhì)含量并不高，結(jié)果顯示與研究材料中貴州當(dāng)?shù)匦←湹牡鞍踪|(zhì)含量相當(dāng)，在13.82%～16.97%之間，其原因可能是由于地域、環(huán)境和氣候等多方面的因素所致，使其高蛋白基因不表達(dá)。另外，田間試驗(yàn)表明，材料PI638740的成熟期比其他小麥研究材料提前1周左右。這跟Avivi等[18]學(xué)者的研究結(jié)果是一致的。這說(shuō)明該研究材料在地理環(huán)境等都發(fā)生很大變化之后其目標(biāo)基因的表達(dá)仍然沒有受到太大的影響，其余3份高蛋白研究材料截然相反，目標(biāo)基因不但沒有表達(dá)，成熟時(shí)間也改變了。因此，對(duì)高蛋白材料PI638740來(lái)說(shuō)是比較穩(wěn)定的，有望將其控制高蛋白基因GPC-B1聚合到優(yōu)質(zhì)的、含有其他優(yōu)良基因比如抗病基因，優(yōu)質(zhì)亞基等的小麥品種（品系）中，以提高小麥的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，滿足當(dāng)今人們對(duì)小麥的食用要求。

貴州當(dāng)?shù)匦←滈L(zhǎng)期存在且仍有待解決的問題是品質(zhì)差，蛋白質(zhì)含量普遍較低是最受關(guān)注并試圖解決的問題之一。提高小麥蛋白質(zhì)含量、改良其品質(zhì)的最高效、最可行的方法是通過傳統(tǒng)育種和分子標(biāo)記相結(jié)合的途徑，轉(zhuǎn)育選育蛋白質(zhì)含量較高、品質(zhì)較好的品種（或品系），再根據(jù)現(xiàn)有育種基礎(chǔ)和育種目標(biāo)，通過品種間雜交、遠(yuǎn)緣雜交等途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

通過研究表明，與傳統(tǒng)的鑒定方法相比，分子標(biāo)記多用于目的基因的鑒定，具有方便快捷的特點(diǎn)。分子標(biāo)記主要是用于田間性狀的輔助篩選，這樣既可以減輕田間的勞動(dòng)強(qiáng)度，又可以加快推進(jìn)目標(biāo)品種的選育進(jìn)程。因此，在今后小麥高蛋白基因的鑒定及高蛋白含量品種的選育中，分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法的應(yīng)用將會(huì)具有更廣泛的用途和更寬闊的前景。

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