徐尤勇，高健，徐虹，曹燦，黃巍巍

1(南京工業(yè)大學食品與輕工學院、材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京，211816)2(鹽城工學院化學與生物工程學院，江蘇鹽城，224051)

2，3-丁二醇是一種重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、食品、燃料及航空航天等領域，具有生物降解性［1－2］。2，3-丁二醇含有2個手性碳原子，因此具有3種旋光異構(gòu)體(分別為R，R-2，3-丁二醇、S，S-2，3-丁二醇和 meso-2，3-丁二醇)。R，R-2，3-丁二醇除了具有上述用途以外，還是優(yōu)良的抗凍劑，也是合成手性試劑、手性配體的重要中間體，在手性藥物和天然產(chǎn)物的合成中也有潛在的重要應用［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)，能夠代謝合成R，R-2，3-丁二醇的微生物寥寥無幾，而多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa，前稱Bacillus polymyxa)是其中唯一具備工業(yè)化生產(chǎn)R，R-2，3-丁二醇潛力的微生物［4－5］。P.polymyxa 中的極少數(shù)菌株能夠產(chǎn)菊粉酶，可以直接利用能源植物菊芋菊粉(菊糖)一步法發(fā)酵制備高附加值的R，R-2，3-丁二醇。菊芋中主要成分為菊粉，占濕重的15% ～20%、干重的80%左右。菊粉是一種生物多糖，它由果糖分子通過β(1→2)鍵連接，聚合程度為2～60，一般平均為10，其終端為葡萄糖單位，故又稱為果聚糖。菊粉經(jīng)菊粉酶或酸降解可轉(zhuǎn)化為果寡糖和果糖［6］。

受胞外蛋白水解酶及多種復雜化學物質(zhì)作用，P.polymyxa分泌的菊粉酶極易失活，導致其在發(fā)酵過程中水解菊粉的酶活并不高，并伴隨發(fā)酵的進行酶活逐漸下降。分批發(fā)酵高濃度的菊芋菊粉制備R，R-2，3-丁二醇時，通過工藝條件優(yōu)化，依然底物利用率低、殘?zhí)嵌?，產(chǎn)物產(chǎn)量提高收效甚微，嚴重制約了R，R-2，3-丁二醇的工業(yè)化發(fā)酵制備［7］。改用連續(xù)發(fā)酵工藝，由于底物濃度等發(fā)酵條件受到嚴格限制，菊粉酶活力和菊芋菊粉的利用均獲得了提高，然而底物濃度受限的發(fā)酵條件也決定了產(chǎn)物產(chǎn)量甚至比分批發(fā)酵低。補料分批發(fā)酵是介于分批培養(yǎng)過程與連續(xù)培養(yǎng)過程之間的一種過渡培養(yǎng)方式，是指在分批培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，又稱半連續(xù)培養(yǎng)或半連續(xù)發(fā)酵。補料分批發(fā)酵工藝已經(jīng)被廣泛應用于抗生素、鼠李糖脂、威蘭膠、氨基酸和維生素等產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)［8－10］，而 P.polymyxa利用菊芋菊粉和葡萄糖補料分批發(fā)酵制備R，R-2，3-丁二醇尚未見相關報道。

一些研究表明，分別利用葡萄糖、純菊粉、果糖和蔗糖等糖類作為碳源時，P.polymyxa發(fā)酵制備R，R-2，3-丁二醇效果差，產(chǎn)量均極低，而利用菊芋菊粉粗提液直接作為發(fā)酵底物時，產(chǎn)物產(chǎn)量得到大幅度提高。原因分析顯示，菊芋菊粉粗提液中還含有一些微量元素、特殊氨基酸和稀有維生素等成分，這些物質(zhì)有利于發(fā)酵目標產(chǎn)物的合成［11］。因此，理性設計P.polymyxa補料分批發(fā)酵制備 R，R-2，3-丁二醇策略，在發(fā)酵前期，直接以菊芋菊粉粗提液中的菊粉為初始碳源，在發(fā)酵后期添加合適的糖類，特別是葡萄糖，不僅有利于底物碳源的利用，提高底物的轉(zhuǎn)化率，而且可促進產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇的合成，從而為工業(yè)化應用奠定良好的基礎。

在前期研究基礎上［11］，根據(jù) P.polymyx ZJ-9利用菊芋菊粉粗提液一步法發(fā)酵制備R，R-2，3-丁二醇的特點，在分批發(fā)酵過程中進行補料，分別以葡萄糖、純菊粉、果糖、蔗糖為補料底物，進行發(fā)酵效果分析，進而對菊粉和葡萄糖混合發(fā)酵工藝條件進行系統(tǒng)深入研究，采用補料分批發(fā)酵工藝以期達到提高底物利用率和目標產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇產(chǎn)量的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株以及培養(yǎng)條件

菌株:多粘類芽抱桿菌 (Paenibacillus polymyxa)ZJ-9，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCC No.3044［12］。

活化培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，瓊脂10～20，pH 7.0。取冰箱保藏菌株劃線到活化培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)30℃恒溫培養(yǎng)1d。

種子培養(yǎng)基(g/L):菊粉20，蛋白胨10，酵母膏3，NaCl 5，配好的種子液115℃滅菌30 min，置于30℃，200 r/min的搖床中培養(yǎng)22 h至對數(shù)生長中后期。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):菊粉 75，酵母膏 6，蛋白胨2，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO43.09，MnSO4·H2O 0.001，NH4Cl 0.93，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.04，ZnSO4·7H2O 0.001，pH 6.0［11］。

1.2 培養(yǎng)方法

補料分批發(fā)酵:補糖濃度500 g/L，分別以3種不同方式補料添加:(1)一次全加，在發(fā)酵24 h時添加30 g/L的葡萄糖;(2)恒速流加，在發(fā)酵24～40 h時以恒定速度流加30 g/L的葡萄糖;(3)分批補加，分別在24 h，31 h時添加15 g/L的葡萄糖。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將上述培養(yǎng)好的種子液按8%的接種量接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，30℃ ，120 r/min搖瓶培養(yǎng)44 h。

7.5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)(BioFlo110，美國 NBS公司):溫度30℃，通氣量1 vvm，裝液量4 L，接種量8%，前22 h轉(zhuǎn)速為300 r/min，后22 h調(diào)為200 r/min，pH調(diào)控策略為:發(fā)酵初期不控發(fā)酵液pH，待發(fā)酵過程中隨著pH值降到6.0以下時，用4 mol/L NaOH調(diào)pH為6.0。

1.3 菊芋菊粉粗提液制備

新鮮的菊芋洗凈，對半切，沸水浴中煮5 min(滅PPO酶);切絲，75℃于電熱恒溫鼓風干燥箱干燥8 h;干絲用粉碎機粉碎，過40目篩，將得到的粗菊粉于冰箱中保存?zhèn)溆谩０凑?∶6的比例稱取粗菊粉于水中攪拌后，70℃水浴加熱浸提2 h，冷卻后用 Ca(OH)2調(diào)pH置10.0，80℃水浴加熱浸提1 h，用6層紗布，過濾后即可得到菊粉粗提液［13］。

1.4 發(fā)酵液細胞干重的測定

取不同時間段的發(fā)酵液稀釋25倍于分光光度計660 nm下檢測OD660。取5 mL發(fā)酵液于預先稱重的離心管中，8 000 r/min室溫離心10 min，棄去上清液再加人5 mL生理鹽水反復洗滌2次，棄上清液，將沉淀置于80℃的烘箱內(nèi)烘干至恒重，烘干后的總重量減去離心管重即為細胞干重(Dry Cell Weight，DCW)。以OD660為橫坐標，DCW為縱坐標，作OD660-DCW的標準曲線。

1.5 發(fā)酵液總糖的測定

配制100 mg/L的果糖標準液，分別取0.1，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1 mL 的果糖標準液用蒸餾水稀釋到1 mL與4 mL的蒽酮沸水浴反應10 min，流動水冷卻測出OD620，以空白作對照制作標曲。

吸取1 mL待測樣品(將發(fā)酵液稀釋1 000倍)，加入4 mL蒽酮試劑，做3個平行;另外吸取1 mL蒸餾水，加入4 mL蒽酮試劑，以此作為對照。將對照和待測樣品沸水浴保溫10 min，取出流動水冷卻至室溫，620 nm測吸光值。再在標曲中查找相應的總糖含量(g/L)。

1.6 發(fā)酵液R，R-2，3-丁二醇，乙偶姻產(chǎn)量測定

發(fā)酵液R，R-2，3-丁二醇，乙偶姻產(chǎn)量測定采用氣相色譜法檢測，利用面積外標法定量。取1 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min，取上清液按1∶1體積比加入乙酸乙酯萃取，靜置分層后取上層清液進行氣相分析。

檢測條件:毛細管色譜柱DB-WAX，30 m×250 μm ×0.5 μm;進樣口溫度210 ℃，進樣量 0.4 μL;分流比20∶1;載氣為高純N2，流速1.2 mL/min;柱溫保持150℃;FID檢測器，檢測器溫度210℃。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉粗提液菊粉濃度對R，R-2，3-丁二醇發(fā)酵的影響

以菊芋菊粉粗提液直接作為發(fā)酵底物，控制粗提液中菊粉含量分別為 65.0、75.0、85.0、95.0 g/L，其他條件相同，進行發(fā)酵培養(yǎng)。檢測分批發(fā)酵過程中菊粉消耗、菌體生長和R，R-2，3-丁二醇產(chǎn)量等各參數(shù)，并進行比較，結(jié)果如表1所示，伴隨初糖濃度的增加，菊粉利用率以及R，R-2，3-丁二醇的生產(chǎn)強度出現(xiàn)下降趨勢，高初糖濃度下(95.0 g/L)最為明顯，說明發(fā)酵液中菌體分泌的菊粉酶酶活有限，培養(yǎng)基初糖濃度過高，細胞合成產(chǎn)物的能力相對減弱;另一方面，菊粉濃度的增加雖然對提高R，R-2，3-丁二醇的產(chǎn)量、最大生物量(DCW)有積極作用，但是，發(fā)酵液中菊粉殘留量也相應增加，原料利用率呈下降趨勢。由此可見，對于R，R-2，3-丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)，分批培養(yǎng)難以實現(xiàn)高產(chǎn)率、高轉(zhuǎn)化率和高生產(chǎn)強度的統(tǒng)一，因此有必要采用補料分批培養(yǎng)來實現(xiàn)R，R-2，3-丁二醇的高產(chǎn)。

表1 菊粉粗提液不同菊粉濃度下R，R-2，3-BD發(fā)酵過程參數(shù)Table 1 The process for one-step fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers with different inulin concentration using P.polymyxa ZJ-9 to produce R，R-2，3-BD

實驗中進一步考察了65.0、75.0、85.0和95.0 g/L的菊粉質(zhì)量濃度對分批發(fā)酵過程中細胞比生長速率和產(chǎn)物比合成速率的影響，如圖1所示。在所考察的菊粉濃度范圍內(nèi)，菌體均能較好的生長，但菊粉濃度過高時，發(fā)酵前期細胞的比生長速率和產(chǎn)物的比合成速率都明顯受到抑制，發(fā)酵周期相對延長;發(fā)酵后期，適當提高糖濃度，有利于產(chǎn)物產(chǎn)量的提高。在發(fā)酵前期，菊粉質(zhì)量濃度為75.0 g/L時，細胞比生長速率，R，R-2，3-丁二醇比合成速率兩者均處于最優(yōu)水平，同時菌體在此濃度下生長較好，菊粉的利用率也較高，因此在R，R-2，3-丁二醇的補料分批發(fā)酵中，將初糖質(zhì)量濃度選擇在75.0 g/L左右是比較合適的，在發(fā)酵后期補加碳源，提高糖濃度，將促進R，R-2，3-丁二醇的合成。

圖1 不同菊粉濃度對細胞比生長速率和產(chǎn)物比合成速率的影響Fig.1 Comparison of kinetic parameters in R，R-2，3-BD batch fermentation by P.polymyxa ZJ-9 under different initial inulin concentration

2.2 補糖種類的確定

前期研究過程中發(fā)現(xiàn)，P.polymyxa ZJ-9分批發(fā)酵能較好地利用菊芋菊粉粗提液作為發(fā)酵底物，而以葡萄糖，純菊粉，果糖，蔗糖等糖類作為碳源時，發(fā)酵產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇的產(chǎn)量均很低，分析原因，可能是菊芋菊粉粗提液中一些微量元素、維生素和氨基酸等成分促進了發(fā)酵產(chǎn)物的合成［11］。補料分批發(fā)酵，前期以菊芋菊粉粗提液作為發(fā)酵底物，控制菊粉的初始質(zhì)量濃度為75.0 g/L左右，在發(fā)酵后期分別考察補料添加葡萄糖、純菌粉、果糖和蔗糖對菌體生長和產(chǎn)物合成影響情況。

從圖1可以看出，在發(fā)酵后期(發(fā)酵22 h后)添加碳源有利于菌體生長和R，R-2，3-丁二醇的合成，因此選擇在發(fā)酵22 h(此時菌粉質(zhì)量濃度已降到約25 g/L)時，分別添加20.0 g/L的葡萄糖、純菊粉、果糖、蔗糖，當碳源濃度再次降到25 g/L時，第二次分別添加20.0 g/L相同的底物。由圖2可知，在7.5 L發(fā)酵罐中，P.polymyxa ZJ-9能夠很好利用補加的葡萄糖、菊粉、果糖、蔗糖，與分批發(fā)酵相比，通過兩次脈沖補加糖，R，R-2，3-丁二醇的產(chǎn)量得到了提高。其中葡萄糖的利用效果最好，發(fā)酵44 h產(chǎn)量達到49.5 g/L，為同批次最高，其次是菊粉、果糖和蔗糖，蔗糖的利用率相對較低，發(fā)酵44 h產(chǎn)量僅達到42.8 g/L，殘?zhí)沁_到17.6 g/L。伴隨發(fā)酵進行，P.polymyxa ZJ-9能夠有效地利用上述補料添加的糖類，表明菊芋菊粉粗提液中殘存的微量元素、維生素和氨基酸等成分能夠繼續(xù)促進菌株對添加碳源的利用。考慮發(fā)酵液最終產(chǎn)物的產(chǎn)量以及葡萄糖成本相對較低，補糖分批發(fā)酵選擇補加葡萄糖為研究對象。然而，實驗發(fā)現(xiàn)補糖分批發(fā)酵在提高產(chǎn)量的同時，最終發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛认鄬^高，在補加葡萄糖的發(fā)酵液中仍然殘留9.4 g/L，因此有必要對混合發(fā)酵菊粉和葡萄糖補料分批發(fā)酵工藝條件進行進一步改進。

圖2 P.polymyxa ZJ-9發(fā)酵合成R，R-2，3-BD的補料分批發(fā)酵過程曲線Fig.2 The production of R，R-2，3-BD by P.polymyxa ZJ-9 with Fed-batch fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers using different sugar supplemention

2.3 菊粉和葡萄糖混合發(fā)酵工藝條件研究

由上述研究可知，當補加40.0 g/L的葡萄糖時，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度依然達到約10 g/L，表明補加的葡萄糖過量，最終確定補料分批發(fā)酵的過程中添加30.0 g/L葡萄糖。在7.5 L發(fā)酵罐中，研究了一次性補加，恒速流加，分批補加三種不同補料方式對P.polymyxa ZJ-9混合發(fā)酵菊粉和葡萄糖對合成R，R-2，3-丁二醇的影響，在發(fā)酵末期分別測量 DCW，R，R-2，3-丁二醇，乙偶姻，殘?zhí)菨舛鹊惹闆r。圖3可以看出，22 h之前為菌體大量生長階段，22 h以后，為產(chǎn)物大量合成階段，與對照相比，通過后期補糖有利于P.polymyxa ZJ-9對糖的利用率，并促進產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇大量積累。其中分批補加方式(圖3d)，即分別在22 h(此時菌粉質(zhì)量濃度已降到約25 g/L)和31 h(此時總糖濃度再次降到約25 g/L)分別補加15.0 g/L的葡萄糖，發(fā)酵到44 h時，R，R-2，3-丁二醇的產(chǎn)量達到最大值約47.8 g/L，殘?zhí)橇可?，同時，菌體量相對較高。分析原因，可能一次性補加葡萄糖時，過多的糖抑制了菌體的生長代謝，不利于產(chǎn)物的合成。而恒速流加補糖，發(fā)酵周期延長，菌體生長代謝能力低，底物利用效率不高，殘?zhí)嵌?，導致產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇產(chǎn)量偏低。

表2可以看出，補料分批發(fā)酵終點與分批發(fā)酵相比細胞干重有所提高，其中分批補加方式細胞干重達到22.6 g/L。通過分批補加葡萄糖，R，R-2，3-丁二醇達到了47.8 g/L，與對照相比，糖轉(zhuǎn)化率由原來的34.9%提高到45.5%，生產(chǎn)強度由原來的0.70 g/(L·h)提高到1.09 g/(L·h)。所以，補料分批發(fā)酵對于菌體的生長、產(chǎn)物的合成以及糖轉(zhuǎn)化率等均具有積極作用。此外，補料分批發(fā)酵終點，殘?zhí)菨舛认鄬^低，有利于工業(yè)化應用。

圖3 不同的補料方式對發(fā)酵合成R，R-2，3-BD的影響Fig.3 Effects of different feeding glucose methods in R，R-2，3-BD production with Fed-batch fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers by P.polymyxa ZJ-9

表2 7.5 L發(fā)酵罐中不同補料方式發(fā)酵過程參數(shù)比較Table 2 Comparison of feeding glucose methods in R，R-2，3-BD production with Fed-batch fermentation of raw inulin extract from Jerusalem artichoke tubers by P.polymyxa ZJ-9

2.4 25 L發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵擴大實驗

為了驗證P.polymyxa ZJ-9混合發(fā)酵菊粉和葡萄糖制備R，R-2，3-丁二醇發(fā)酵工藝條件的可行性，在25 L發(fā)酵罐上進行了擴大實驗。如圖4所示，通過補料分批發(fā)酵，當發(fā)酵44 h時，R，R-2，3-丁二醇產(chǎn)量達到最高值48.5 g/L，而乙偶姻以及殘?zhí)窍鄬^低，分別為 1.34 g/L 和 3.2 g/L，碳源對 R，R-2，3-丁二醇轉(zhuǎn)化率達到46.2%，從而證明了P.polymyxa ZJ-9混合發(fā)酵菊粉和葡萄糖合成R，R-2，3-丁二醇最佳發(fā)酵工藝條件的可行性和可操作性，為工業(yè)化發(fā)酵制備R，R-2，3-丁二醇奠定了堅實的基礎。

3 結(jié)論

圖4 25 L發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵過程Fig.4 The producction of R，R-2，3-BD by P.polymyxa ZJ-9 with Fed-batch fermentation of mixture of inulin and glucose in a 25 L bioreactor

本研究選取菊芋菊粉粗提液直接作為發(fā)酵前期底物，考察不同初始菊粉濃度發(fā)酵條件下的P.polymyxa ZJ-9 細胞比生長速率(μ)和 R，R-2，3-丁二醇比合成速率(qp)，在此基礎上，分別補料添加葡萄糖、菊粉、果糖和蔗糖進行發(fā)酵效果分析比較，確定了補料添加葡萄糖的發(fā)酵策略，并在7.5 L發(fā)酵罐上進行了分批、補料分批工藝研究。通過上述發(fā)酵工藝條件研究，最終確定了P.polymyxa ZJ-9混合發(fā)酵菊粉和葡萄糖制備R，R-2，3-丁二醇的最佳工藝條件。研究結(jié)果表明，該補料分批發(fā)酵工藝具有成本低、效率高和適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢。

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