王穎

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,合肥 230061)

缺血性腦血管病是一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病,致死率和致殘率較高,發(fā)病率逐年上升,且有年輕化的趨勢(shì)。急性腦梗死的主要治療目標(biāo)是搶救可逆性缺血損害。研究表明,在眾多因素中,治療時(shí)機(jī)的選擇也是影響缺血損害有效保護(hù)的關(guān)鍵因素之一。超過(guò)一定的時(shí)間界限,缺血損害則變?yōu)椴豢赡?此時(shí)無(wú)論采取任何治療手段都收效甚微。因此,在治療上出現(xiàn)時(shí)間窗概念。Pulsinelli WA等[1]首先提出了治療時(shí)間窗,其認(rèn)為在腦缺血發(fā)作后,于一定時(shí)間內(nèi)給予積極治療,可減輕腦損傷的程度,促進(jìn)機(jī)能恢復(fù),并改善長(zhǎng)期的預(yù)后。這個(gè)允許的時(shí)間稱為治療時(shí)間窗。Rho/ROCK信號(hào)通路參與了多種腦梗死危險(xiǎn)因素的產(chǎn)生,在腦梗死急性期和亞急性期以及恢復(fù)期過(guò)程中均起著重要作用,抑制腦缺血后 ROCK活性已經(jīng)成為治療缺血性腦血管病的新靶點(diǎn)。針刺治療缺血性腦卒中臨床取得比較滿意的療效[2-6],但其對(duì)于Rho/ROCK信號(hào)的影響及其對(duì)下游效應(yīng)因子的調(diào)控作用尚不明確,故筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究,觀察不同時(shí)間針刺治療對(duì) Rho/ROCK信號(hào)的影響,明確針刺抑制局灶性缺血性再灌注大鼠 ROCK表達(dá)的最佳時(shí)間段,以最大程度保護(hù)和改善缺血后的腦組織損傷,為臨床選擇最佳時(shí)間應(yīng)用針刺治療缺血性腦血管病提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取180只成年Wista雄性大鼠(安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重(250±30)g,鼠齡為12 w,隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組和針刺組,模型組和針刺組又分為6 h、24 h、48 h、72 h和2 w5個(gè)亞組,共12組,每組15只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

RIPA細(xì)胞裂解液及BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所提供);SDS(德國(guó)Serva公司);甘氨酸(美國(guó)AMRESCO公司);TEMED與Tris堿(美國(guó)Sigma公司);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);超薄切片機(jī)(瑞典LKB-V型);過(guò)硫酸氨、丙烯酰胺(美國(guó)Sigma公司);電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(美國(guó) Pierce公司);甲醇購(gòu)于上海中試化工總公司;丙烯酰胺(Fluka公司);甲叉雙丙烯酰胺(美國(guó) AMRESCO公司抗體);Rock1(美國(guó)Proteintech公司,編號(hào) 21850-1-AP);Actin(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,編號(hào) TA-09);二抗分別為山羊抗小鼠 IgG(編號(hào) ZB2305)和山羊抗兔 IgG(編號(hào)ZB2301)。

AF-10型自動(dòng)制冰機(jī)(意大利 SCOTSMAN);EPS300型電泳儀、VE-180型電泳槽和 VE-186型轉(zhuǎn)膜儀(Tanon);LX300型微量離心機(jī)(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司);JW-3021HR高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司);微量移液器(德國(guó)Eppendorf);針灸針(蘇州天協(xié)針灸器械有限公司);魚(yú)線(安徽太平洋漁具有限公司)。

1.3 造模方法

使用線栓法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈復(fù)制局灶性腦缺血模型,術(shù)后大鼠出現(xiàn)左側(cè)偏癱,提尾懸拉時(shí)出現(xiàn)左上肢蜷縮屈曲或被動(dòng)性過(guò)度伸展,同時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、跌倒,即可納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 模型評(píng)估

神經(jīng)功能缺失評(píng)估與死亡率分別于建模前、麻醉清醒后及術(shù)后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)大鼠參考Longa EZ等[7]的方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)估,其中每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組各取5只大鼠評(píng)分結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。0分為無(wú)神經(jīng)功能缺失;1分為左側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲;2分為自主運(yùn)動(dòng)時(shí)身體向左側(cè)劃圈;3分為身體向左側(cè)傾倒;4分為不能自主行走并伴有意識(shí)障礙。1分以上收入實(shí)驗(yàn)分組,觀察期內(nèi)死亡動(dòng)物剔除并予以補(bǔ)足。

1.5 處理方法

所有大鼠給予普通飲食,假手術(shù)組僅作頸動(dòng)脈分離,空白組和假手術(shù)組于造模后第2天取材檢測(cè),模型組中各小組分別于造模后6 h、24 h、48 h、72 h和2 w取材檢測(cè)。

針刺組分別于再灌注后 6 h、24 h、48 h、72 h和2 w進(jìn)行針刺。取百會(huì)、大椎、足三里。大鼠百會(huì)穴位于頂骨正中;大椎穴定位第7頸椎與第1胸椎間,背部正中;足三里穴定位在膝關(guān)節(jié)后外側(cè),在腓骨小頭下約 5 mm處。采用 0.35 mm×13 mm毫針刺入穴位,進(jìn)針后輕度捻轉(zhuǎn),以局部輕顫為度,留針 30 min,期間每15 min行針1次。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估

各組大鼠經(jīng)各自處理后,對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估,依然參考Longa EZ等[7]的方法。

1.6.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

①組織勻漿及蛋白的提取;②電泳;③轉(zhuǎn)膜;④封閉;⑤一抗孵育;⑥二抗孵育;⑦蛋白檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以析因設(shè)計(jì)的方差分析作差異的顯著性分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型組和針刺組大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較

由表1、圖1可見(jiàn),模型組大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分與針刺組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。針刺組再灌注6 h的神經(jīng)功能評(píng)分與同組其他再灌注時(shí)間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 各組不同時(shí)間段ROCK表達(dá)比較

由表2及圖2、圖3可見(jiàn),模型組(缺血再灌注6 h、24 h、48 h、72 h)ROCK表達(dá)與空白組比較,均顯著上調(diào)(P＜0.05),其中6 h ROCK表達(dá)達(dá)到峰值。針刺組(缺血再灌注6 h、24 h、48 h)ROCK表達(dá)與模型組(缺血再灌注 6 h、24 h、48 h)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01,P＜0.05),其中針刺缺血再灌注6 h組ROCK下調(diào)最為顯著。而針刺組(缺血再灌注72 h、2 w)ROCK表達(dá)與模型組(缺血再灌注72 h、2 w)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 針刺組與模型組神經(jīng)功能缺損評(píng)分與ROCK表達(dá)相關(guān)性分析

由圖 4可見(jiàn),針刺 6 h組腦缺血再灌注模型大鼠ROCK表達(dá)下調(diào)最為顯著,與針刺組(24 h、48 h、72 h)比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同時(shí)針刺6 h組神經(jīng)功能評(píng)分下調(diào)幅度最大,與針刺組(24 h、48 h、72 h)比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 模型組和針刺組大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較 (±s,分)

表1 模型組和針刺組大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較 (±s,分)

注:與模型組比較1)P＜0.05;與同組再灌注6 h比較2)P＜0.05

組別 n 再灌注6 h 再灌注24 h 再灌注48 h 再灌注72 h 再灌注2 w模型組 75 3.20±0.41 2.60±0.51 2.00±0.65 1.40±0.51 0.80±0.41針刺組 75 2.80±0.411) 2.20±0.411)2) 1.60±0.511)2) 1.00±0.651)2) 0.60±0.511)2)

表2 各組大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)ROCK表達(dá)活性比較 (±s)

表2 各組大鼠缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)ROCK表達(dá)活性比較 (±s)

注:與模型組比較1)P＜0.01,2)P＜0.05;與同組再灌注6 h比較3)P＜0.05;與空白組比較4)P＜0.05;與假手術(shù)組比較5)P＜0.05

組別 n 再灌注6 h 再灌注24 h 再灌注48 h 再灌注72 h 再灌注2 w空白組 15 1.31±0.02 - - - -假手術(shù)組 15 1.32±0.02 - - - -模型組 75 2.96±0.014)5) 2.81±0.014)5) 2.71±0.014)5) 2.62±0.014)5) 1.47±0.02針刺組 75 1.77±0.021) 1.98±0.022)3) 2.19±0.022)3) 2.57±0.013) 1.47±0.013)

圖1 模型組和針刺組大鼠腦缺血再灌注各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分

圖2 模型組不同時(shí)間ROCK表達(dá)比較

圖3 針刺組不同時(shí)間ROCK表達(dá)比較

圖4 兩組神經(jīng)功能缺損評(píng)分與ROCK表達(dá)相關(guān)性分析

4 討論

Rho/ROCK通路是人和動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的一條信號(hào)傳導(dǎo)通路,它參與多種生物學(xué)行為,包括細(xì)胞增殖與凋亡、調(diào)控細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞粘附與遷移等[8-9]。近些年來(lái),關(guān)于ROCK抑制劑進(jìn)行了大量的動(dòng)物試驗(yàn)及臨床研究,也證實(shí)了ROCK活性與缺血性腦卒中的密切關(guān)系[10]。它在保護(hù)皮型一氧化氮合酶的活性、修復(fù)神經(jīng)損傷、抑制炎癥反應(yīng)、防治動(dòng)脈粥樣硬化等具有顯著的優(yōu)勢(shì)[11-15]。Yagita Y等[16]發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)皮細(xì)胞ROCK表達(dá),可以阻止卒中后腦梗死體積的擴(kuò)大,改善神經(jīng)功能。Satoh S等[17]研究發(fā)現(xiàn),ROCK抑制劑鹽酸法舒地爾通過(guò)降低血液黏稠度并阻止腦組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的聚集,減少梗死體積,促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。由此可見(jiàn),抑制ROCK表達(dá)對(duì)于缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能恢復(fù)具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)主要精選百會(huì)、大椎、后三里等穴位對(duì)局灶性腦缺血再灌注模型大鼠進(jìn)行針刺,動(dòng)態(tài)觀察模型大鼠ROCK的變化,確定最佳針刺時(shí)間點(diǎn)。百會(huì)為督脈要穴,又稱三陽(yáng)五會(huì),入絡(luò)于腦,有通督調(diào)神之功。《普濟(jì)方》:“凡忽中風(fēng),言語(yǔ)謇澀,半身不遂……穴百會(huì),耳前發(fā)際,……神效?！贝笞禐橹T陽(yáng)之會(huì),是手足三陽(yáng)經(jīng)與督脈交會(huì)穴,具有宣通諸陽(yáng)之氣而通督活絡(luò)之效?！缎妈T銅人腧穴針灸圖經(jīng)》:“手足三陽(yáng)、督脈之會(huì)。”足三里為足陽(yáng)明經(jīng)合穴,以調(diào)和經(jīng)脈、疏通氣血,還可健脾胃以運(yùn)化水濕和水谷精微。三穴合用可奏通督調(diào)神、行氣活血之功。神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果顯示,針刺組(6 h、24 h、48 h、72 h)與模型組點(diǎn)對(duì)點(diǎn)比較均具有顯著差異(P＜0.05),說(shuō)明針刺可以有效改善模型大鼠的神經(jīng)功能缺損狀況,促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)。其中,針刺6 h組神經(jīng)功能缺損評(píng)分下調(diào)幅度最大,與針刺24 h、48 h、72 h組相比具有顯著差異(P＜0.05);觀察不同時(shí)間點(diǎn)針刺對(duì)局灶性腦缺血大鼠ROCK的表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,假手術(shù)組與空白組ROCK表達(dá)相比較沒(méi)有顯著差異(P＞0.05);模型組(缺血再灌注6 h、24 h、48 h、72 h)與空白組相比較ROCK表達(dá)均顯著上調(diào)(P＜0.05),2 w組與空白組相比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。其中,缺血再灌注 6 h ROCK上調(diào)達(dá)到峰值。針刺組(6 h、24 h、48 h)ROCK表達(dá)與模型組(缺血再灌注 6 h、24 h、48 h)點(diǎn)對(duì)點(diǎn)比較具有顯著差異(P＜0.05)。其中,缺血再灌注 6 h針刺組 ROCK下調(diào)最為顯著,而針刺組(72 h、2 w組)ROCK表達(dá)與模型組(72 h、2 w組)比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由此可見(jiàn),ROCK表達(dá)與腦缺血再灌注損傷有著密切的聯(lián)系,在大鼠腦缺血再灌注的不同時(shí)間點(diǎn)ROCK表達(dá)呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)演變的過(guò)程。其中,腦缺血再灌注6 h ROCK上調(diào)最為顯著,隨著時(shí)間的推移ROCK表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),直到缺血再灌注2 w與正?？瞻捉M趨向一致。而針刺的介入對(duì)于腦缺血再灌注大鼠ROCK的調(diào)節(jié)也呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)演變的過(guò)程,腦缺血再灌注6 h后針刺對(duì)ROCK下調(diào)最為顯著,隨后ROCK表達(dá)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),直到缺血再灌注2 w針刺組與正?？瞻捉M趨向一致。而腦缺血再灌注6 h恰為缺血性腦血管病的超級(jí)性期,本實(shí)驗(yàn)證明針刺對(duì)于超級(jí)性期缺血性腦血管病大鼠ROCK的下調(diào)具有顯著意義,可以更大程度保護(hù)和改善神經(jīng)功能,這為臨床尋找缺血性腦血管病最佳治療時(shí)間點(diǎn)提供了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)也為腦缺血治療提供新的靶點(diǎn)。

[1]Pulsinelli WA, Jacewicz M, Levy DE,et al. Ischemic brain injury and the therapeutic window[J]. Ann N Y Acad Sci, 1997,835:187-193.

[2]孫世曉,武桂娟.滯針兼透刺療法治療中風(fēng)肢體痙攣狀態(tài)臨床觀察[J].針灸臨床雜志,2006,22(6):37-38.

[3]陳文,顧紅衛(wèi),馬維平,等.針刺足三里、懸鐘對(duì)缺血性中風(fēng)患者腦血管功能的影響:多中心隨機(jī)對(duì)照研究[J].中國(guó)針灸,2006,26(12):851-853.

[4]彭君華,于海波,皮敏,等.調(diào)任通督針刺法結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練治療缺血性中風(fēng)的臨床觀察[J].廣東醫(yī)學(xué),2009,29(8):1410-1411.

[5]歐陽(yáng)鋼,賈少微,王凡,等.不同電針刺激頻率對(duì)腦卒中患者腦血流灌注和腦功能的影響[J].中國(guó)針灸,2005,25(11):776-778.

[6]張晨茜,儲(chǔ)浩然,程紅亮,等.針刺風(fēng)池、風(fēng)府穴對(duì)缺血性腦卒中患者血漿內(nèi)皮素的影響[J].上海針灸雜志,2012,31(1):15-17.

[7]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[8]Etienne-Manneville S, Hall A. Rho GTPases in cell biology[J]. Nature,2002,420(6916):629-635.

[9]Buchsbaum RJ. Rho activation at a glance[J]. J Cell Sci, 2007,120(7):1149-1152.

[10]Marinissen MJ, Chiariello M, Tanos T,et al. The small GTP-binding protein RhoA regulates c-jun by a ROCK-JNK signaling axis[J]. Mol Cell, 2004,14(1):29-41.

[11]Shin HK, Salomone S, Potts EM,et al. Rho-kinase inhibition acutely augments blood flow in focal cerebral ischemia via endothelial mechanisms[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2007,27(5):998-1009.

[12]Wolfrum S, Dendorfer A, Rikitake Y,et al. Inhibition of Rho-kinase leads to rapid activation of phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase Akt and cardiovascular protection[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24(10):1842-1847.

[13]Feske SK, Sorond FA, Henderson GV,et al. Increased leukocyte ROCK activity in patients after acute ischemic stroke[J]. Brain Res,2009,1257:89-93.

[14]Fournier AE, Takizawa BT, Strittmatter SM. Rho kinase inhibition enhances axonal regeneration in the injured CNS[J]. J Neurosci, 2003,23(4):1416-1423.

[15]Lingor P, Tonges L, Pieper N,et al. ROCK inhibition and CNTF interact on intrinsic signaling pathways and differentially regulate survival and regeneration in retinal ganglion cells[J]. Brain, 2008,131(1):250-263.

[16]Yagita Y, Kitagawa K, Sasaki T,et a1. Rho-kinase activation in endothelial cells contributes to expansion of infarction after focal cerebral ischemia[J]. J Neurosci Res, 2007,85(11):2460-2469.

[17]Satoh S, Toshima Y, Hitomi A,et a1. Wide therapeutic time window for Rho kinase inhibition therapy in ischemic brain damage in a rat cerebral thrombosis model[J]. Brain Res, 2008,l193:102-108.