河北大學附屬醫(yī)院耳鼻喉科 (保定071000)

張 馳 杜錦朵 趙 雷 冉 程

RECK、MMP-14及VEGF在喉癌組織中的表達及臨床意義*

河北大學附屬醫(yī)院耳鼻喉科 (保定071000)

張 馳 杜錦朵 趙 雷 冉 程

目的：探討逆轉錄誘導蛋白基因(RECK)、基質金屬蛋白酶-14(MMP-14)和血管內皮細胞生長因子(VEGF)在喉癌組織中的表達及其臨床意義。方法：應用免疫組織化學檢驗法(S-P法)檢測74例喉癌患者、45例癌旁組織和40例正常粘膜組織中的RECK、MMP-14以及VEGF的陽性表達率，并探討其臨床意義。結果：喉癌組織中RECK蛋白表達量低于癌旁組織和正常組織，癌組織中表達與癌旁組織表達比較有統(tǒng)計學意義；癌旁組織和正常組織相比無統(tǒng)計學意義；MMP-14在喉癌組織中的陽性率高于癌旁組織和正常粘膜組織，前兩者相比有統(tǒng)計學意義，后兩者相比無統(tǒng)計學意義；VEGF在正常粘膜組織中無表達，在喉癌組織中的陽性率高于癌旁組織和正常粘膜組織，前兩者相比有統(tǒng)計學意義，后兩者相比無統(tǒng)計學意義。結論：RECK、MMP-14在喉癌組織、癌旁組織和正常粘膜組織均有表達；RECK在喉癌發(fā)生發(fā)展中不起關鍵作用；MMP-14的表達可能與喉癌的發(fā)生、侵襲和轉移有關；VEGF在正常粘膜組織中無表達， 蛋白表達水平隨腫瘤分化程度而異，與臨床分期的早晚和淋巴結的轉移呈正相關。

喉癌在我國北方地區(qū)發(fā)病率較高，93%～99%為鱗狀細胞癌。RECK是伴有Kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白，是一種新型基質金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑和腫瘤抑制基因，可在轉錄后水平抑制多種MMPs的表達，對抑制腫瘤的侵襲、生長、轉移和血管生成有一定的作用。MMP-14是一種特殊蛋白酶，屬于基質金屬蛋白酶家族，是一類以細胞外基質蛋白為主要底物的一組鋅依賴性肽鏈內切酶的總稱。不但介導腫瘤細胞對宿主，包括基底膜在內的細胞外基質(ECM)的降解，還具有促進腫瘤細胞新血管形成，影響和調控著腫瘤細胞的生長的作用。VEGF為血管內皮生長因子，在新生血管的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。有研究表明，它也是腫瘤血管形成的特殊因子。在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、腎癌、膀胱癌、結腸癌等腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)過VEGF的表達[1]。本研究通過研究RECK、MMP-14和VEGF在喉癌組織、癌旁組織和正常組織的表達情況，探討其與喉癌發(fā)生發(fā)展的關系。

材料與方法

1 一般資料 收集自2011年6月至2013年6月之間收治的喉癌患者74例，取其癌部組織74份、癌旁組織45份和40例非喉癌患者正常粘膜組織作對照。喉癌患者74例中，男性50例，女性24例，年齡42～73歲，平均年齡55±2.5歲,中位年齡59歲；所有患者均經(jīng)CT、MRI或PET-CT檢查，病理組織活檢切片均確診為鱗狀細胞癌，癌旁組織和正常粘膜組織均經(jīng)病理學證實為炎癥或正常粘膜。

2 方法和材料

2.1 檢測方法：應用免疫組化(S-P)法檢測74例喉癌組織、45例癌旁組織和40例正常喉粘膜組織中RECK、MMP-14和VEGF的表達情況。

2.2 標本采集和貯存：74例喉癌組織、45例癌旁組織和40例正常喉粘膜組織皆為手術新鮮標本。標本離體后，一部分放入4%多聚甲醛中行石蠟切片免疫組化研究，一部分做好標記置于液氮中。貯存于零下80°超低溫冰箱貯存?zhèn)洳椤?/p>

2.3 主要試劑：一抗，RECK兔抗人多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，MMP-14兔抗人多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，VEGF兔抗人單克隆抗體為北京中彬金橋公司。二抗，羊抗兔FITC、IgG抗體(Jackson Immtmo Research公司)

2.4 操作流程：所有標本均經(jīng)過4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、連續(xù)切片，如果是冰凍貯存的石蠟切片應常規(guī)浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟10min，梯度酒精沖洗，PBS漂洗后侵入檸檬酸中，微波爐抗原修復10min，再次PBS漂洗，滴加一抗液，濕盒內4°C過夜，DAB液顯色，PBS漂洗終止反應[2]。蘇木素復染，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察。試驗設PBS代替一抗為空白對照，作為質量控制標準。

2.5 結果判定：RECK、MMP-14和VEGF判斷標準相同，陽性表達染色為細胞膜和細胞質，胞漿為主，周圍間質部分著色，以細胞著色均勻完整為陽性細胞。陽性表達收弱到強呈淺黃、棕黃、棕褐色顆粒狀。每例隨機觀察10個高倍視野，鏡下(×400)計100個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞占視野總細胞數(shù)的百分比，取平均值。陽性細胞數(shù)<5%為0分(-)，5%～25%為1分(+)，26%～50%為2分(++)，51%～75%為3分(+++)，染色結果以>25%為陽性表達或者記分2分和3分者視為陽性表達。

2.6 統(tǒng)計學方法：使用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計數(shù)資料行χ2檢驗，標準檢驗α=0.05。

結 果

1 RECK在喉癌中的表達情況，見表1。 根據(jù)在細胞中的染色著色，我們按著色的淺深(-～+++)分為四個等級。RECK癌組織中陽性表達率20.26%<癌旁組織中陽性表達率84.45%<正常組織中陽性表達率92.5%。可以看出RECK在癌組織、癌旁組織和正常組織中陽性表達率呈逐漸上升趨勢。癌組織中陽性表達例數(shù)與癌旁組織陽性表達例數(shù)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；癌組織中陽性表達例數(shù)與正常組織中陽性表達例數(shù)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而癌旁組織中陽性例數(shù)與正常組織中陽性例數(shù)相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 RECK在癌組織、癌旁組織、正常粘膜 組織中的陽性表達(%)

2 MMP-14在喉癌組織中的陽性表達，見表2。根據(jù)在細胞中的染色著色在細胞漿，我們按著色的淺深(-～+++)分為四個等級。MMP-14在癌組織中的陽性率為78.37%>癌旁組織為31.11%，>正常組織 17.5%?？梢钥闯鯩MP-14在癌組織、癌旁組織和正常組中陽性表達率呈逐漸下降趨勢。癌組織陽性表達例數(shù)與癌旁組織陽性例數(shù)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；癌組織和正常組織陽性例數(shù)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而癌旁組織和正常組織陽性例數(shù)相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 MMP-14在癌組織、癌旁組織、正常粘膜 組織中的陽性表達(%)

3 VEGF在喉癌中的表達情況，見表3。根據(jù)在細胞中的染色著色在細胞漿，我們按著色的淺深(-～+++)分為四個等級。以++和+++定為陽性表達，可以看出VEGF在癌組織、癌旁組織和正常組中陽性表達率呈逐漸下降趨勢。VEGF在癌組織中陽性表達率為70.26%>癌旁組織陽性表達率24.45%>正常組織10.0%。在癌組織中的陽性例數(shù)和癌旁組織陽性例數(shù)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；癌組織和正常組織陽性例數(shù)相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；癌旁組織和正常組織相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 在癌組織、癌旁組織、正常粘膜 組織中的VEGF陽性表達(%)

討 論

喉癌是一組來源于喉粘膜上皮組織的惡性腫瘤，發(fā)病率在5.7%～7.6%，在耳鼻喉科領域中僅次于鼻咽癌和鼻竇癌，位居第三位[3]。好發(fā)年齡在50～70歲，以吸煙男性居多。城市高于農(nóng)村，北方地區(qū)高于南方地區(qū)，環(huán)境污染與發(fā)病有關。其中聲門型占60%之多，聲門上型居中，聲門下型很少見。多為鱗狀細胞癌，其發(fā)生和發(fā)展可能與組織中多種因素的原癌基因表達有關[4]。

RECK是1998年日本學者發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤抑制基因，具有獨特抵制MMP-14蛋白酶活性和表達作用，可抑制腫瘤的血管形成和侵襲性。許多研究表明，RECK基因作為一個獨立因素在肺癌、胰腺癌、結腸癌、直腸癌等腫瘤組織中的表達程度，與患者的預后有密切相關，腫瘤組織中RECK的呈高表達時，則具有較小的侵襲性，提示預后良好[5]。

MMP-14是基質金屬蛋白酶家族成員之一，迄今發(fā)現(xiàn)的該種酶類有26種，MMP1-26、MMPs通過降解癌細胞的基底膜，提高其惡性程度和轉移能力，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移等方面扮演著重要角色[6]。

VEGF是目前所知作用最強的促血管生長因子，又稱血管通透因子。由于其特異性高，對新生血管內皮細胞的增殖分裂、遷移、血管構建，起著中心調控作用，是血管內皮細胞特異的有絲分裂源，在腫瘤組織中高表達已被研究者廣泛關注。

本文研究發(fā)現(xiàn)，RECK在喉癌中的陽性表達率為15/74(20.27%),明顯低于癌旁組織和正常組織，提示RECK對喉癌的發(fā)生、發(fā)展不起關健作用。其在癌組織中表達與癌旁組織表達兩者有統(tǒng)計學意義；而癌旁組織和正常組織間無統(tǒng)計學意義。

而MMP-14在喉癌組織中呈陽性高表達，在癌旁組織和正常組織中的陽性表達率呈遞減狀態(tài)。也有不少研究證實，MMP-14在胃癌、乳腺癌等癌癥組織中同樣呈陽性高表達，與本研究結果相一致。提示MMP-14的表達，可能與喉癌的發(fā)生、侵襲和轉移有關

本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF在喉癌中的陽性表達率為52/74(70.27%),并在有淋巴結轉移的情況下呈陽性高表達，提示VEGF有促進腫瘤細胞的轉移。VEGF以其強大的促分裂能力，助長了腫瘤細胞的分裂增殖，加速了腫瘤新生血管的形成，增加腫瘤內細胞血管通透性，為轉移灶的形成提供了必要的途徑和血供[7]。

本研究表明，RECK蛋白在喉鱗癌組織中低表達，其在喉癌的發(fā)生發(fā)展中應該不起關鍵作用,但其表達程度有可能與喉癌的侵襲、轉移及預后有關，尚待進一步研究。喉鱗癌組織中MMP-14蛋白，VEGF蛋白表達呈正相關，MMP-14與VEGF在刺激喉鱗癌生成、轉移中有協(xié)同作用[8,9]。有助于分析并尋找喉鱗癌新的基因靶向治療位點。VEGF蛋白表達水平隨腫瘤分化程度的高低而呈現(xiàn)不同的表達，與臨床分期的早晚和淋巴結的轉移的出現(xiàn)呈正相關。提示其可作為喉癌程度增高的標志。

[1] 魯賽帥，倪昊生，劉 浩，等.VEGF在喉癌中的表達及臨床意義[J].南通大學學報，2013，3：179-181.

[2] 左文娜，胡俊蘭，馮立春，等. RECK、MMP-14在喉癌組織中的表達及臨床意義[J].山東醫(yī)藥，2012，52(31)：73-74.

[3] 張金玲，費 雁，陳 偉，等.MMP-2、MMP-14、TIMP-2在胃癌組織中的表達及意義[J].華中科技大學學報：醫(yī)學版，2013，42(2)：227-230.

[4] 徐志華，王繼群，張 濤，等.VEGF在喉癌中的表達的Meta分析[J].山東大學耳鼻喉眼學報，2008，22(1)：32-33，45.

[5] 李 楠，李小敏.STAT3與VEGF在喉癌中的研究進展[J].醫(yī)學綜述，2012，18(9)：1319-1321.

[6] 高 珊，盧國友，王竹君，等.PT TG和VEGF-C在喉癌組織中的表達及其與微淋巴管生成的關系[J].重慶醫(yī)學，2014，43(4)：434-436.

[7] 劉春麗，張圣林，馬桂琴，等.MMP-1、Ets-1在喉癌組織中的表達及其臨床意義[J].臨床耳鼻喉頭頸外科雜志，2011，25(24)：322-325.

[8] 許大巍.喉鱗癌患者血漿MMP-9及VEGF-C檢測的臨床意義[J].中國保健營養(yǎng)，2014，24(4)：109-110.

[9] 武彥昭，施惠晶，景尚華，等.喉癌組織中VEGF-C及其受體VEGFR-3和D2-40表達及意義[J].山東醫(yī)藥，2013，53(41)：4-7.

(收稿：2014-10-23)

* 河北省科技攻關計劃項目(062761152)

喉腫瘤/免疫學 @逆轉誘蛋白基因 基質金屬蛋白酶14/分析 血管內皮生長因子/分析

R392.3

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10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.007