西安市第一醫(yī)院 (西安 710002)

朱海峰 王 亮

細菌脂多糖作用下角膜上皮細胞Toll樣受體2、4動態(tài)變化研究

西安市第一醫(yī)院 (西安 710002)

朱海峰 王 亮

目的：觀察角膜上皮細胞在細菌脂多糖作用后不同時間Toll樣受體(TLR)2、4表達的動態(tài)變化，初步明確TLR 在角膜細菌感染和保持免疫穩(wěn)態(tài)中的作用。方法：培養(yǎng)永生化人角膜上皮細胞系，分別用10ng/ml和1μg/ml的細菌脂多糖(LPS)刺激, 作用2h、4h、8h后檢測TLR2、4的表達，4h、8h、12h后檢測細胞分泌IL-6能力。結(jié)果：不同濃度LPS刺激后，細胞TLR2、4的mRNA表達水平在不同時點均明顯增高，但隨著刺激時間延長，細胞表面蛋白表達和IL-6的分泌水平則呈現(xiàn)先升后降的趨勢。結(jié)論：人角膜上皮細胞(HCE)能夠表達功能性的TLR2、4，并且在接受刺激后，TLR蛋白表達和炎癥因子分泌具有負反饋抑制。

感染性角膜病變是全球主要的致盲性眼病，角膜所處的解剖位置特殊，容易受到創(chuàng)傷和感染等各種外界因素的刺激。由于角膜自身沒有血管,角膜的天然免疫狀態(tài)對外來感染刺激物的反應(yīng)類型和程度直接決定了感染是否發(fā)生以及發(fā)生后轉(zhuǎn)歸。Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)是在天然免疫中發(fā)揮重要作用。已有部分研究證實,角膜上皮細胞(CEC)和角膜基質(zhì)成纖維細胞能夠表達功能性的TLRs,對病原微生物的識別和啟動免疫的能力對眼組織免于遭受病原侵襲至關(guān)重要，同時TLR信號通路所誘發(fā)的角膜炎癥也嚴重損害角膜組織和視功能[1～3]。為此本研究觀察了不同濃度細菌脂多糖( Lipopolysaccharide, LPS )作用不同時間，角膜上皮細胞中TLR2、4表達的動態(tài)變化，旨在揭示TLR 在角膜細菌感染和保持免疫穩(wěn)態(tài)中的作用。

材料與方法

1 材 料 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑購自美國Invitrogen公司。SYBR Green PCR試劑購自美國ABI公司。LPS購自美國Sigma公司兔抗人TLR2、4多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，F(xiàn)ITC標記山羊抗兔IgG購自中杉金橋。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng): 參考Araki-Sasaki等[4]所述方法，SV40永生化的人角膜上皮細胞系(Human corneal epithelial cell line, HCEC)生長DMEM /F12培養(yǎng)液中，添加10%FBS、5 μg/ml胰島素、0.1 μg/ml霍亂毒素、5ng/ml人表皮生長因子、100U/ml 青霉素、100mg/ml鏈霉素，培養(yǎng)于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。

2.2 LPS刺激: 將細胞傳代接種到6孔板中(每孔3×108)，分別在細胞培養(yǎng)液中加入濃度為10ng/ml和1μg/ml的細菌LPS, 培養(yǎng)2h、4h、8h后檢測TLR2、4表達，4h、8h、12h后檢測細胞分泌IL-6能力。

2.3 qRT-PCR檢測TLR2、4 mRNA表達: LPS處理后的細胞，TRIzol提到總RNA，合成cDNA，設(shè)定反應(yīng)體系為25μl，取SYBR Green PCR Master Mix12.5μl，上下游引物(見附表)各20pmol，模板cDNA 50ng，加去離子水至25μl，應(yīng)用ABI7500 PCR儀進行反應(yīng)。反應(yīng)條件均為50℃，2min，1個循環(huán)；95℃，10min，延伸95℃，15s，60℃，1min，40個循環(huán)。另取不同的模板濃度(0.2ng、2ng、20ng、200ng)進行PCR反應(yīng)，制定各基因的標準曲線，并測定各樣本PCR反應(yīng)液的熔解曲線。每樣本做3個復(fù)管。2-△△CT方法計算各基因的相對表達量。

附表 Real time PCR引物序列

2.4 流式細胞儀熒光染色檢測功能性TLR2、4 表達: 收集LPS處理后的細胞，使用4%多聚甲醛固定，分別與兔抗人TLR2、4，多克隆抗體室溫geyc孵育1h，以BSA為陰性對照。FITC標記二抗(山羊抗兔熒光二抗)2μl孵育30min(避光)，BSA緩沖液漂洗5min×2次，流式細胞儀檢測FITC的熒光強度。

2.5 ELISA檢測細胞分泌IL-6能力: 將細胞懸液濃度調(diào)整為106/ml，96孔板中接種細胞100μl/孔，按預(yù)定時間加入LPS刺激后，按試劑盒說明操作，顯色結(jié)束后30min以內(nèi)在酶標儀上讀取結(jié)果。

結(jié) 果

1 LPS對HCEC中TLR mRNA表達影響: qRT-PCR顯示與未處理組相比，HCEC接受不同濃度的LPS刺激后不同時點TLR2、4的mRNA水平均明顯升高(P<0.05)，高濃度刺激作用更為明顯(圖1)。

圖1 LPS對HCEC中TLR mRNA表達的影響(與未刺激組相比，*P<0.05)

2 LPS對HCEC表面功能性TLR 2、4表達的影響: 流式細胞儀結(jié)果顯示與未處理組相比，HCEC接受不同濃度的LPS刺激后不同時點TLR2、4熒光染色陽性細胞的比例呈現(xiàn)先升后降的趨勢(P<0.05)，高濃度LPS作用更為明顯(圖2)。

A:流式細胞儀分析示意圖，橫坐標為熒光強度，縱坐標為細胞數(shù)量，M2區(qū)表示熒光染色陽性細胞，B：流式細胞儀結(jié)果統(tǒng)計

圖2 LPS對HCEC表面功能性TLR 2、4表達的影響(與未刺激組相比，*P<0.05)

3 LPS對HCEC IL-6分泌的影響: 結(jié)果顯示與未處理組相比，HCEC接受不同濃度的LPS刺激后，上清液中IL-6的含量明顯增多，但4h后IL-6含量未明顯增加(圖3)。

(與未刺激組相比，*P<0.05)圖3 LPS對HCEC IL-6分泌的影響

討 論

TLRs廣泛存在于各種生物體內(nèi)，不僅在先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，而且還能夠調(diào)節(jié)獲得性免疫，是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分。TLRs作為模式識別受體，能夠特異性地識別病原微生物在進化過程中保守的抗原分子，從而誘導機體免疫應(yīng)答。TLR在眼表炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用[5、6]。

從1997年第1個TLR即TLR4被發(fā)現(xiàn)至今，已經(jīng)在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了TLR1～TLR13共13個成員[7]。目前的研究顯示角膜上皮細胞在mRNA水平表達TLR1～TLR10，但在蛋白水平僅表達TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9，并且是否表達為功能性受體還存在爭議[8、9]。由于永生化的HCE細胞在建系和傳代過程中保持了正常的TLR表達，被認為是研究人角膜上皮TLR表達和功能的良好細胞系。為此，本研究SV40永生化的HCE細胞系為研究對象，結(jié)果顯示細胞表面可檢測到TLR2、4，并且LPS刺激后細胞能夠分泌IL-6，說明HCEC能夠表達功能性的TLR。宿主防御機制的重要部分就是其免疫識別系統(tǒng)識別外來微生物并對其反應(yīng)。TLR2和TLR4是TLR家族中研究最早也是目前研究最清楚的成員之一，在LPS介導的炎癥反應(yīng)中起主要作用。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激后HCEC內(nèi)mRNA和胞膜上功能性受體的表達水平明顯增多，IL-6分泌增多，說明細胞在接受細菌產(chǎn)物后能夠啟動炎癥反應(yīng)有效抵御感染。但值得注意的是，隨著刺激時間的延長，雖然TLRTLR2、4的mRNA表達仍然明顯高于未刺激細胞，但胞膜表面的功能性受體蛋白表達卻呈現(xiàn)下降趨勢，甚至低于未刺激細胞。這與Erdinest[10]等的結(jié)果相似，說明HCE細胞TLR受體的表達存在轉(zhuǎn)錄后水平的負反饋調(diào)節(jié)。IL-6的分泌水平通常在刺激后4h達到高峰，但其半衰期僅有16min。本研究結(jié)果顯示培養(yǎng)體系中IL-6的含量4h以后隨著時間延長，未再明顯增加，甚至出現(xiàn)了下降趨勢，表明LPS刺激引起的炎癥反應(yīng)得到了一定程度的抑制。

綜上所述，HCE能夠表達功能性的TLR2、4，并且在接受刺激后，TLR蛋白表達和炎癥因子分泌具有負反饋抑制，這可能是角膜上皮雖長期暴露在外界微生物及其產(chǎn)物的環(huán)境下，卻能保持免疫靜息環(huán)境的機制之一，細胞功能受損則可能TLR調(diào)節(jié)失效，進而導致角膜不可控性炎癥，嚴重損害角膜組織和視功能。

[1] Lambiase A, Micera A, Sacchetti M,etal. Toll-like receptors in ocular surface diseases:Overview and new findings[J]. Clinical Science, 2011,120(10):441-50.

[2] Redfern RL, Mc Dermott AM. Toll-like receptors in ocular surface disease[J]. Experimental Eye Research,2010,90(6):679-87.

[3] Wong Y, Sethu C, Louafi F,etal. Lipopolysaccharide regulation of toll-like receptor-4 and matrix metalloprotease-9 in human primary corneal fibroblasts[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2011,52(5):2796-803.

[4] Araki-Sasaki K, Ohashi Y, Sasabe T,etal. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science,1995,36(3):614-21.

[5] Pandey RK, Yu FS, Kumar A. Targeting toll-like receptor signaling as a novel approach to prevent ocular infectious diseases[J]. The Indian journal of medical research,2013,138(5):609-19.

[6] Kumar A, Yu FS. Toll-like receptors and corneal innate immunity[J]. Current Molecular Medicine, 2006,6(3):327-37.

[7] Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signalling[J]. Nature Reviews Immunology,2004,4(7):499-511.

[8] 高建魯, 吳欣怡. Toll樣受體在人眼角膜上皮和永生化人角膜上皮細胞系的表達及功能研究[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2005,85(32):2269-73.

[9] 高建魯, 吳欣怡. 人角膜上皮細胞Toll樣受體介導的炎性細胞因子的表達[J]. 中華眼科雜志, 2006,42(7):628.

[10] Erdinest N, Aviel G, Moallem E,etal. Expression and activation of toll-like receptor 3 and toll-like receptor 4 on human corneal epithelial and conjunctival fibroblasts[J]. Journal of Inflammation,2014,11(1):3.

(收稿：2014-10-13)

Dynamic changes in expression of Toll like receptor on cornea epithelial cells induced by lipopolysaccharide

The First Hospital of Xi’an (Xi’an 710002)

Zhu Haifeng Wang Liang

Objective:To evaluate the dynamic changes in expression of Toll like receptor on cornea epithelial cells induced by lipopolysaccharide and illustrate the effect of TLR in the bacterial infection and Immune homeostasis.Methods: Immortalized human corneal epithelial cell was treated by 10ng/ml and 1μg/ml lipopolysaccharide. The expression of TLR2 and 4 were detected with qRT-PCR from mRNA level and FACS from protein level, at 2, 4, and 8 hours after stimulation. The IL-6 level was examined by ELISA at 4, 8, and 12 hours after stimulation。Results: After stimulation with LPS, cells elicited an increase in the content of TLR2 and 4 specific mRNA at each time point. The cell surface expression of TLR and IL-6 secretion increased at early stage but decreased at late stage of LPS exposure.Conclusion: TLR 2 and 4 cell surface expression in HCE cell can recognize the stimulation of LPS, and their expression pattern constitutes a negative-feedback loop that is important in the bacterial infection and Immune homeostasis environment in the human cornea.

@ Toll like receptor Epitheliumcorneal Interleukin-6/metabolism Lipopolysaccharides/metabolism Imnunomodulation

@ Toll樣受體 上皮角膜 白細胞介素-6/代謝 脂多糖類/代謝 免疫調(diào)節(jié)

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.005