西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安 710061)

劉慧娟▲ 劉 佳▲ 車 宇▲ 張曉智△

γ射線聯(lián)合2450MHz電磁輻射對C3H10T1/2細(xì)胞生長和惡性轉(zhuǎn)化的影響

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安 710061)

劉慧娟▲劉 佳▲車 宇▲張曉智△

目的：觀察γ射線和2450 MHz電磁聯(lián)合輻射對C3H10T1/2小鼠胚芽細(xì)胞增殖能力、惡性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。方法：將C3H10T1/2細(xì)胞按電磁輻射強度隨機分為對照組(0mW/m2)、電磁輻射低劑量組(15mW/m2)、中劑量組(30mW/m2)和高劑量組(50mW/m2)，聯(lián)合組同時給予6Gy的γ射線照射。檢測C3H10T1/2小鼠胚芽細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期和凋亡情況；用免疫組化和圖像分析技術(shù)檢測細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，單純電磁輻射處理的細(xì)胞存活率和細(xì)胞轉(zhuǎn)化未發(fā)生改變， γ射線與高劑量電磁輻射聯(lián)合組存在惡性轉(zhuǎn)化。γ射線組和復(fù)合組于輻射后3h S期細(xì)胞顯著減少，G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高，電磁輻射組細(xì)胞凋亡率輕度增高，而γ射線組和復(fù)合組則升高較為顯著，且復(fù)合組引起細(xì)胞的凋亡率升高較單純γ射線組更明顯，照射后Bax表達(dá)增強。結(jié)論：γ射線與電磁輻射復(fù)合照射后C3H10T1/2細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期和凋亡，2450MHz電磁輻射可進(jìn)一步加強γ射線對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期及凋亡的誘導(dǎo)作用。Bax在γ射線和2450MHZ電磁聯(lián)合輻射導(dǎo)致C3H10T1/2細(xì)胞發(fā)生凋亡且較單純組加重方面起重要作用。

γ射線和2450MHz電磁輻射是生活和工作環(huán)境中兩種典型的輻射影響因素，其生物效應(yīng)和對健康的影響一直倍受關(guān)注。但往往在進(jìn)行健康危險程度評價時，都簡單地假定處于某一種危害因素之中，所致的健康損害效應(yīng)也是單獨的。但在一些特殊職業(yè)環(huán)境如腫瘤放射治療臨床實踐中，卻可能存在著電離輻射和電磁輻射復(fù)合照射的情況[1]。從目前研究來看，報道不同類型輻射間的聯(lián)合毒效應(yīng)相對較少。本實驗觀察γ射線和2450MHz電磁輻射復(fù)合照射后C3H10T1/2小鼠胚芽細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和惡性轉(zhuǎn)化的變化，并探討兩者之間可能的聯(lián)合效應(yīng)。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 BME培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、二甲基亞砜 (DMSO)、青霉素、鏈霉素等(上海生工)，培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板(Coming公司)、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(Biopec)，60Coγ射線放射源(由輻照中心提供)，微波功率場強儀(Narda公司)，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司)。

2 電磁輻射系統(tǒng) 2450MHz電磁輻照暴露裝置由信號發(fā)生器、電磁信號功率放大器和輻照屏蔽室組成。電磁信號發(fā)生器發(fā)出的信號由功率放大器放大并輸入輻照屏蔽室內(nèi)，經(jīng)過發(fā)射端產(chǎn)生電磁場。內(nèi)部的電磁場功率密度由探頭接收后經(jīng)電腦讀出。

3 方 法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與照射分組：8克隆的C3H10T1/2小鼠胚芽細(xì)胞在含4mmol/L左旋谷酰胺和10%胎牛血清(整個實驗都用同一批號的血清)Eagle氏基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Eagle’s basal medium, BME)培養(yǎng),培養(yǎng)箱溫度保持在37℃內(nèi)含5%CO2，0.05%EDTA-Trypsin消化傳代。每次實驗復(fù)蘇一管同代凍存細(xì)胞。

將細(xì)胞隨機分為對照組、15、30和50mW/m2暴露組。第2天細(xì)胞貼壁后采用60Co輻照γ射線照射，劑量率為1Gy/min(由本院輻照中心提供)，γ射線照射后放入電磁輻射輻照系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行輻照，2h/d，連照7d后第8天分為電磁輻射組和聯(lián)合組，聯(lián)合組接受6Gy的γ射線照射。細(xì)胞分組為M0組(0Gy，0mW/m2)、M1組(0Gy，15mW/m2)、M3組(0Gy，30mW/m2)、M5組(0 Gy，50mW/m2)、IM0組(6Gy，0mW/m2)、IM1組(6Gy，15mW/m2)、IM3組(6Gy，30mW/m2)、IM5組(6Gy，50mW/m2)。

3.2 細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)化分析：細(xì)胞暴露后隨機分為兩份:一份接種200個細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿中，共5個樣本用于檢測細(xì)胞毒性；另一份接種2000個細(xì)胞于10cm培養(yǎng)皿中，用于檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用含10%血清的培養(yǎng)液(BME-10)每周換液2次，1周左右用于檢測細(xì)胞毒性的5個樣本皿細(xì)胞先用PBS洗2遍，再用含10%甲醛的姬姆薩染料染色固定計數(shù)克隆。大約3～4周待細(xì)胞轉(zhuǎn)化組細(xì)胞匯合，此后更換5%血清的培養(yǎng)液(BME-5)培養(yǎng)，每周換液1次，6～7周左右細(xì)胞轉(zhuǎn)化組細(xì)胞用PBS洗2遍，再用含10%甲醛的姬姆薩染料染色固定計數(shù)轉(zhuǎn)化灶。計算每103存活細(xì)胞轉(zhuǎn)化灶的發(fā)生頻率，計算公式如下:

體外細(xì)胞轉(zhuǎn)化(In vitro cell transformation)是指在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長、增殖和分化等特性發(fā)生失控的變化，以及由此而導(dǎo)致的贅生物表象和裸鼠體內(nèi)成瘤。轉(zhuǎn)化灶的定義使用Reznikoff等的經(jīng)典定義。每組實驗至少重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用鄧奈特(氏)檢驗方差分析計算。

3.3 細(xì)胞周期測定：照射后，在每個時間點，細(xì)胞(1×106)經(jīng)消化液消化后，離心，70%乙醇固定，然后PI染色，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞周期分布(應(yīng)用軟件名稱為MedFit LT)。

3.4 蛋白雜交：各實驗組細(xì)胞首先用4C的PBS緩沖液沖洗1次，接著用橡皮擦將細(xì)胞刮落于1 ml PBS中，離心得到沉淀，細(xì)胞沉淀經(jīng)冷凍-解凍-冷凍幾次后，在沸水中煮沸3min，最后加樣于12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。電泳后，蛋白被電轉(zhuǎn)移至Hybond-ECL硝化纖維素膜。膜上的非特異性部位用免疫雜交液4℃過夜進(jìn)行封閉。所用抗體如下：小鼠抗Bax單克隆抗體,抗小鼠IgG辣根過樣化物酶。雜交后的條帶用ECL試劑盒進(jìn)行顯色。

3.5 流式細(xì)胞儀的凋亡測定：各實驗組細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，試劑盒為Annexin-V-FLUOS。實驗過程遵試劑盒說明。

結(jié) 果

1 2450MHz電磁輻射、γ射線射線單獨及聯(lián)合照射對細(xì)胞集落形成率的影響：與對照組M0比較，單獨電磁輻射照射組M5細(xì)胞的增殖活性下降;聯(lián)合組中與單獨電離IM0相比，IM3和IM5組細(xì)胞的增殖活性明顯下降，其中IM5組細(xì)胞的增殖活性下降尤為顯著。各組細(xì)胞的增殖百分率，見表1。

2 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯(lián)合照射對細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響：與對照組M0比較，單獨電磁輻射照射組、單獨γ射線組、聯(lián)合組中IM1組細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化改變較低，聯(lián)合組中IM3和IM5組細(xì)胞的有細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化與與對照組M0比較惡性轉(zhuǎn)化增加(P﹤0.01)。各實驗組細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化結(jié)果，見表1。

3 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯(lián)合照射對細(xì)胞周期分布的影響：如表2所示，未發(fā)現(xiàn)單獨2450MHz電磁輻射暴露改變C3H10T1/2細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。γ射線聯(lián)合2450MHz電電磁輻射聯(lián)合加強細(xì)胞周期阻滯于G1期和G2期效應(yīng)。電磁輻射波聯(lián)合γ射線照射后3 h，細(xì)胞輕微堆積于G0/G1期，G0/G1期細(xì)胞的百分比從對照組的71%增加87%。增加的幅度在照射后6h變得更明顯。24h G0/G1期細(xì)胞周期恢復(fù)。微波暴露對于在24h范圍內(nèi)γ射線誘導(dǎo)的G1和G2期阻滯沒有影響。

表1 2450MHz電磁輻射波、γ射線射線單獨及聯(lián)合照射對細(xì)胞集落形成率和細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響±s)

注：PE=集落形成率;Fi=有轉(zhuǎn)化灶;Fo=無轉(zhuǎn)化灶; TII= II型轉(zhuǎn)化灶; TIII= III型轉(zhuǎn)化灶;TII+III=II型轉(zhuǎn)化灶+ III型轉(zhuǎn)化灶;SE=標(biāo)準(zhǔn)誤；與M0組或IM0組比較， *P<0.01

表2 2450MHz電磁輻射、γ射線射線單獨及聯(lián)合照射對細(xì)胞周期分布的影響±s，%)

注：與M0組或IM0組比較，*P<0.01

4 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯(lián)合照射對細(xì)胞凋亡的影響：如圖1所示，單獨電磁輻射作用不能誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞凋亡。6Gyγ射線照射后24 h和72 h，只有少量細(xì)胞發(fā)生了凋亡(約占細(xì)胞總數(shù)的2%～3%)。值得注意的是，電離輻射后電磁輻射暴露24h顯著促進(jìn)了γ射線誘導(dǎo)的凋亡，凋亡細(xì)胞從約3%升至0.4%。但在72h時間點電磁輻射對凋亡的促進(jìn)作用消失。

與M0組或IM0組比較，*P<0.01

圖1 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯(lián)合照射對細(xì)胞凋亡的影響

5 2450MHz 電磁輻射、γ射線單獨及聯(lián)合照射對Bax的表達(dá)的影響：為了探討電磁輻射促進(jìn)γ射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平的機制，我們檢測了凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax的表達(dá)。同凋亡的結(jié)果一致，電磁輻射暴露促進(jìn)了γ射線照射后24 h Bax的表達(dá)。輻照后72 h，Bax的表達(dá)恢復(fù)到對照水平，電磁輻射暴露在72 h時間點對Bax的表達(dá)沒有影響。同樣，單獨電磁輻射暴露對Bax的表達(dá)也沒有影響(圖2)。

圖2 2450MHz 電磁輻射、γ射線單獨 及聯(lián)合照射對Bax表達(dá)的影響

討 論

C3H10T1/2細(xì)胞是從C3H小鼠分離建立的間充質(zhì)干細(xì)胞株，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌和內(nèi)皮細(xì)胞，是研究細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞模型，故本次實驗選用此細(xì)胞系。目前有關(guān)電磁輻射和電離輻射的復(fù)合效應(yīng)的報道較少，且存在不一致的結(jié)果。有學(xué)者認(rèn)為，電磁輻射和電離輻射的復(fù)合效應(yīng)與這兩種輻射照射的條件密切相關(guān)，包括照射時間的長短及照射的先后次序等方面，在電離輻射照射后的急性作用期施加電磁輻射，可增加電離輻射效應(yīng)。賈永峰等[2]研究結(jié)果顯示，5.5Gy的γ射線和50 mW/cm2電磁輻射復(fù)合照射可較單純γ射線增加小鼠的死亡率。王中和等發(fā)現(xiàn)[3]利用γ射線和高功率毫米波聯(lián)合照射人舌癌細(xì)胞能明顯抑制該細(xì)胞的克隆能力，且明顯高于單純電磁輻射和γ射線組。張衛(wèi)研究顯示[4]，單獨電磁輻射和γ射線均能抑制SHG44細(xì)胞的生長，且電磁輻射能增強γ射線的作用。陸敏霞研究表明[5]，電磁輻射有降低細(xì)胞活力的作用，且有一定劑量相關(guān)性；高劑量微波(6mW/cm2)聯(lián)合γ射線照射能降低SHG44 細(xì)胞的存活率，且損傷效應(yīng)在細(xì)胞受到電離輻射后能被放大。但也有研究顯示電磁輻射不僅能減輕γ射線所造成的小鼠的輻射損傷，而且能夠促進(jìn)放射損傷后的恢復(fù)。

電磁輻射可能的致癌效應(yīng)是其生物學(xué)效應(yīng)研究中的熱點，近年來電磁致癌效應(yīng)方面的研究越來越多，但至今仍存在分歧。Elizabeth等[6]進(jìn)行過與本實驗相似的實驗研究，他們的研究同樣選用C3H10T1/2細(xì)胞系，分別暴露于三種不同強度2450MHz電磁輻射，時間為24h，X射線為致瘤性轉(zhuǎn)化激動因子，TPA為致瘤性轉(zhuǎn)化促進(jìn)因子，共26種不同的暴露條件，結(jié)果顯示只有在TPA出現(xiàn)時電磁輻射會引起C3H10T1/2細(xì)胞轉(zhuǎn)化頻率隨SAR增加而增加的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

本實驗發(fā)現(xiàn)，γ射線和電磁輻射復(fù)合照射可誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞的生長改變及惡性轉(zhuǎn)化，同時還發(fā)現(xiàn)，在γ射線照射后即刻給予50mW/m2的2450MHz微波照射，能夠進(jìn)一步增強C3H10T1/2細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞生長和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。細(xì)胞生長或凋亡失控都可能通過干擾細(xì)胞更新平衡從而導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生率的增加。本次實驗結(jié)果表明單獨電磁輻射(2450MHz，15、30和50mW/m2)暴露不會引起C3H10T1/2細(xì)胞的生長改變及惡性轉(zhuǎn)化發(fā)生，而且單純電磁輻射暴露也未對細(xì)胞周期分布產(chǎn)生影響。雖然我們的實驗結(jié)果與其他大多數(shù)的研究支持電磁輻射暴露不影響細(xì)胞生長的觀點，但也有相反的研究報道。

有研究顯示，電磁輻射暴露能夠影響γ射線或一些化學(xué)物質(zhì)[6]誘導(dǎo)的細(xì)胞的凋亡程度，但詳細(xì)機制尚不明確。有資料顯示這種現(xiàn)象可能是由于電磁輻射參與了細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的調(diào)節(jié)[7]。如果細(xì)胞通過凋亡通路清除DNA損傷細(xì)胞的能力受到破壞而導(dǎo)致大量受損細(xì)胞在體內(nèi)存留，就會增加腫瘤發(fā)生的危險度。因此，我們觀察了2450MHz電磁輻射對C3H10T1/2細(xì)胞γ射線誘導(dǎo)的凋亡水平的影響。雖然6Gyγ射線只誘導(dǎo)少量細(xì)胞發(fā)生了凋亡，但電磁輻射暴露仍會導(dǎo)致γ射線照射后24h細(xì)胞的凋亡水平升高，照后72 h的細(xì)胞凋亡水平恢復(fù)正常，這表明電磁輻射的暴露對γ射線的照射誘導(dǎo)的凋亡水平的協(xié)同效應(yīng)是短暫的。

Bax是Bcl-2家族引起細(xì)胞凋亡成員之一。Bcl-2/Bax比例在細(xì)胞命運中起重要作用。Bax二聚體形成可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；但Bax表達(dá)降低或Bcl-2表達(dá)增加，Bax與Bcl-2就會形成異源二聚體抑制凋亡的發(fā)生。許多研究表明，電離輻射可調(diào)控Bcl-2家族基因的表達(dá)。有報道顯示C3H10T1/2細(xì)胞受到電離輻射暴露后可低水平表達(dá)Bax[8]。我們的實驗結(jié)果與此報道一致，照射后Bax的表達(dá)是對照水平的1.2倍。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)2450MHz電磁輻射暴露增強了輻照后24h Bax的表達(dá)?？紤]到在同一個時間點電磁輻射也增加了γ射線誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞凋亡水平，因此提示雖然單獨電磁輻射暴露對細(xì)胞生長影響較小，但它可以通過改變C3H10T1/2細(xì)胞Bax的表達(dá)途徑從而影響γ射線誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞凋亡水平。

總之，γ射線和2450MHz電磁輻射復(fù)合后C3H10T1/2細(xì)胞發(fā)生明顯生長改變、惡性轉(zhuǎn)化及凋亡，電磁輻射對γ射線誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞損傷有協(xié)同增強作用，Bax和Bcl-2蛋白在該協(xié)同作用中發(fā)揮重要作用，聯(lián)合照射后是否有其他凋亡調(diào)控基因及蛋白發(fā)揮調(diào)控作用具體途徑，有待進(jìn)一步深入研究。

[1] 張 衛(wèi), 曹 毅, 童 建. 微波與γ射線聯(lián)合照射對細(xì)胞生長增殖的影響[J].中國職業(yè)醫(yī)學(xué), 2008, 35(3):194-196.

[2] 賈永峰，王水明，陳建魁. γ射線與微波復(fù)合作用對小鼠造血系統(tǒng)功能及形態(tài)學(xué)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2006，31(8)：790-793.

[3] 王中和，唐友軍，周曉健. 放射聯(lián)合高功率密度毫米波對人舌鱗癌細(xì)胞的協(xié)同抗瘤效應(yīng)[J]. 實用腫瘤雜志，2000，15(4)：226-229.

[4] 張 衛(wèi)，曹 毅，孟謙謙. 微波與γ射線聯(lián)合照射對細(xì)胞生長增殖的影響[J]. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué)，2008，35(3)：194-196.

[5] 陸敏霞，曹 毅，張 衛(wèi)，等.微波及γ射線單獨或聯(lián)合輻射對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HSP70 表達(dá)的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué) 2009,26(4)：144-147.

[6] Elizabeth K, Balcer K,George H H. Neoplastic transformation of C3H10T1/2 cell following exposure to 120 Hz modulated 2.45 GHz microwaves and phorbol ester tumor promoter[J]. Radiation Res, 1991, 126: 65-72.

[7] Ding G R, Yaguchi H, Yoshida M. Increase in X-ray-induced mutations by exposure to magnetic field (60 Hz, 5 mT) in NF-kappaB-inhibited cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1999,276(1): 238-43.

[8] Sakakura C, Sweeney E A, Shirahama T. Overexpression of bax sensitizes human breast cancer MCF-7 cells to radiation-induced apoptosis[J]. Int J Cancer,1996,67(1): 101-105.

(收稿：2014-11-12)

Effect of cell growth and malignant transformation induced by combination of γ-ray and microwave

First Affiliated Hospital of,Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Liu Huijuan Liu Jia Che Yu et al

Objective：To investigate the interactive effects of 2450 MHz microwave and γ-rays radiation on C3H10T1/2 cells growth，malignant transformation ,Cell cycle and apoptosis．Methods：C3H10T1/2 cells were irradiated with 0，15，30，50mW/m22450 MHz microwave and 6Gy γ-ray radiation．this study was to investigate the possible effects of 2450 MHz microwave at different doses on γ-ray induced transformation in C3HlOT1/2 cells; Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry. Bax expression of cells were detected by immuocytochemical staining with image analysis．Results： Compared with control group, microwave radiation group of cell survival and cell transformation was not changed. there was a significant increase in malignant transformation at γ-ray plus microwave radiation group. cells S stages were significantly decreased，while cells in G0/G1stages were significantly increased at 3 h. Moreover，the amount of apoptosis cells in combined radiation group was more than that in γ-ray irradiation group．In the early days after irradiation，Bax protein expression was raised. Conclusion：γ-ray combined with microwave could induce malignant transformation and apoptosis of C3H10T1/2 cells，and microwave could enhance the effect of γ-ray．The expressions of Bax in harmony may play a role in apoptosis of C3H10T1/2 cell.

Gtamma rays Electromagnetic radiation Cell proliferation Cell transformation,neoplastic Apoptosis Mice

γ射線 電磁輻射 細(xì)胞增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)化，腫瘤 細(xì)胞凋亡 小鼠

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.003

▲陜西省腫瘤醫(yī)院

△通訊作者