雷明輝,葉勁松,張銘容,李 智,李 睿,肖 夢(mèng),張子麗,李昕陽(yáng),鄭伯紅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014)

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶對(duì)雞蛋蛋白熱凝固性的影響

雷明輝,葉勁松*,張銘容,李 智,李 睿,肖 夢(mèng),張子麗,李昕陽(yáng),鄭伯紅

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,四川雅安 625014)

本實(shí)驗(yàn)研究了NaCl濃度、pH、酶作用溫度、酶作用時(shí)間和酶量對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(TGase)處理雞蛋蛋白后其熱凝固所得凝膠的硬度和保水性的影響。并通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)酶作用后雞蛋清樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,以初步探究TGase對(duì)雞蛋蛋白熱凝固性的影響機(jī)理。結(jié)果表明:TGase處理雞蛋蛋清液后其凝膠的硬度和保水性都有極顯著提高(p<0.01)。當(dāng)NaCl濃度為0.4mol/L、pH6.0、溫度35℃、酶作用時(shí)間3.5h、酶量為10U/g蛋白質(zhì)時(shí),雞蛋蛋白凝膠硬度和保水性最大,分別為(134.73±1.79)g和93.83%±0.58%,相比空白組分別提高了58.87%和29.38%。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明:一定條件下,TGase可促進(jìn)雞蛋清中的蛋白質(zhì)分子交聯(lián),從而可改善其熱凝固性。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,雞蛋蛋白,熱凝固性

雞蛋蛋清價(jià)格低廉,營(yíng)養(yǎng)豐富,是重要的食品加工原料。它具有熱凝固性、持水性、起泡性和乳化性等多種功能,其中熱凝固性在食品的生產(chǎn)加工中有重要作用[1],蛋清的熱凝固性有利于蛋白質(zhì)變性形成凝膠,而蛋清凝膠可促進(jìn)蛋制品干燥,改善產(chǎn)品質(zhì)地和持水力等[2-7]。因此,研究雞蛋蛋白的熱凝固性對(duì)增強(qiáng)其在食品工業(yè)中的加工性能有非常重要的意義。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase,EC 2.3.2.13),簡(jiǎn)稱TGase,具有良好熱穩(wěn)定性和親水性,被作為新型的食品添加劑應(yīng)用在食品加工中[8]。TGase可催化蛋白質(zhì)中的?；l(fā)生轉(zhuǎn)移,促使蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間以及蛋白質(zhì)與氨基酸之間發(fā)生交聯(lián)[9]。Bellido等[10]提出蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)后可以改善食品凝膠特性、起泡性、溶解性、乳化性等。目前,TGase已廣泛應(yīng)用于各類食品中以改善其凝膠硬度和保水性等品質(zhì)[11]。然而,TGase應(yīng)用于雞蛋中的研究報(bào)道還很少[12-13],尤其以鮮雞蛋蛋清為對(duì)象研究TGase對(duì)其熱凝固性的影響還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以鮮雞蛋蛋清為研究對(duì)象,研究TGase對(duì)雞蛋蛋白凝膠硬度和保水性的影響。并通過(guò)SDS-PAGE電泳對(duì)TGase處理的雞蛋清中蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,以初步探究TGase對(duì)雞蛋蛋白熱凝固性的影響機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮雞蛋 四川雅安市雨城區(qū)黃家鮮雞蛋供應(yīng)商提供;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶 酶活100U/g,南京龐博生物有限公司;標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白、十二烷基磺酸鈉(SDS)、鹽酸羥胺(hydroxylamine) Sigma公司;考馬斯亮藍(lán)R250 成都市科龍化工試劑廠;丙烯酰胺(超純)、巰基乙醇 Amresco公司。其它試劑均為分析純。

TA-XTplus2型物性測(cè)定儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司;Millipore Milli-Q型優(yōu)普超純水系統(tǒng) 四川優(yōu)普超純科技有限公司;DYCZ-240型電泳儀及電源 北京市六一儀器廠;UV-2102PCS型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 蛋清樣品的制備

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 The experimental flow chart

1.2.2 鮮蛋清的提取 挑選完好潔凈度高的鮮雞蛋在溫水(30℃)中洗凈,用0.4% NaOH液浸泡5min后晾干。用分蛋器使蛋清與蛋黃分離提取出蛋清,除去系帶,用雙層紗布兩次過(guò)濾,經(jīng)磁力攪拌器攪拌10min,并再次過(guò)濾除去氣泡得到均勻鮮蛋清。

1.2.3 鮮蛋清蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[14],將蛋清稀釋100倍后用考馬斯亮藍(lán)G-250稀釋液染色處理,于可見(jiàn)分光光度計(jì)中595nm處進(jìn)行測(cè)定,經(jīng)計(jì)算得出蛋清中蛋白濃度。

1.2.4 鮮蛋清的預(yù)處理 將上述所得鮮蛋清用一定濃度的NaCl溶液稀釋至蛋白濃度為8%,控制蛋清稀釋液中NaCl濃度并調(diào)節(jié)pH,從而得到NaCl濃度和pH一定的蛋清液。

1.2.5 TGase處理蛋清液 將1.2.4所得蛋清液加入即配的TGase溶液,混勻密封于恒溫水浴鍋中處理一定時(shí)間得到TGase處理后的蛋清樣品,并進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)以雞蛋蛋白熱凝固后凝膠的硬度、保水性以及電泳分析為考察指標(biāo),以NaCl濃度、酶作用溫度、pH、酶作用時(shí)間、TGase添加量為影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 NaCl濃度對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 取六組蛋清液,調(diào)整每組樣品pH為6.0,TGase量12U/g蛋白質(zhì),酶作用溫度40℃,酶作用時(shí)間4h,調(diào)整每組NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L,進(jìn)行NaCl濃度的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 酶作用溫度對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 取六組蛋清,調(diào)整每組樣品pH為6.0,TGase量為12U/g蛋白質(zhì),酶作用時(shí)間4h,NaCl濃度0.4mol/L,調(diào)整每組酶作用溫度分別為25、30、35、40、45、50℃,然后進(jìn)行TGase作用溫度單因素的實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 pH對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 取六組蛋清液,調(diào)整每組樣品TGase量為12U/g蛋白質(zhì),酶作用時(shí)間4h,NaCl濃度0.4mol/L,酶作用溫度40℃,調(diào)整每組pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,進(jìn)行pH的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 酶作用時(shí)間對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 取六組蛋清液,調(diào)整每組樣品TGase量為12U/g蛋白質(zhì),NaCl濃度0.4mol/L,pH6.0,酶作用溫度40℃,調(diào)整每組酶作用時(shí)間為0、1、2、3、4、5h,進(jìn)行酶作用時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 TGase添加量對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 取六組蛋清液,調(diào)整每組樣品NaCl濃度為0.4mol/L,pH為6.0,酶作用溫度為40℃,酶作用時(shí)間為4h,調(diào)整每組TGase量為0、4、8、12、16、20U/g蛋白質(zhì),進(jìn)行TGase添加量的單因素實(shí)驗(yàn)。

1.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的前提下優(yōu)化TGase對(duì)雞蛋蛋白熱凝固性作用的各因素水平。以雞蛋蛋白熱凝固后凝膠的硬度和保水性為考察指標(biāo),采用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1),每個(gè)樣品設(shè)定三個(gè)重復(fù)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),并得出各因素水平的最佳組合。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 硬度測(cè)定 參照李利鑫[15]的研究方法并改進(jìn),將TGase處理的樣品經(jīng)熱凝固所得的凝膠于常溫(25℃)下用TA-XTplus2物性測(cè)定儀在TPA模式下測(cè)定凝膠硬度(Hardness)。測(cè)定參數(shù):探頭型號(hào)P/0.5圓柱型探頭,測(cè)前速度為1.0mm/s,測(cè)中采用5.0mm/s的速度,測(cè)后速度為5.0mm/s,測(cè)試位移10mm,觸發(fā)力5g。

1.5.2 保水性測(cè)定 根據(jù)賈丹[16]的研究方法并改進(jìn),樣品80℃水浴處理1h后冷卻至室溫(25℃)形成凝膠稱重m1,然后于3000r/min條件下離心10min,除去水分后稱干物重m2,并計(jì)算保水性(WHC)。

WHC(%)=[(m2-m)/(m1-m)]×100

式中:m-離心管質(zhì)量(g);m1-離心前總質(zhì)量(g);m2-離心后總質(zhì)量(g)。

1.5.3 SDS-PAGE電泳分析 參照Panozzo[17]的方法采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分析。分離膠和濃縮膠的濃度分別為12%和5%。將不同TGase添加量、NaCl濃度、酶作用溫度、pH、酶作用時(shí)間處理后的樣品用超純水稀釋后加入樣品上樣緩沖液終止酶的作用,然后在一定條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳,經(jīng)掃描儀掃描成像后分析蛋白質(zhì)的條帶變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p<0.01為差異極顯著,p<0.05為差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式。折線圖均采用制圖軟件Origin8.1繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 NaCl濃度對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 由圖2知,隨NaCl濃度的增加,樣品的凝膠硬度和保水性呈先升高然后緩慢下降的趨勢(shì)(NaCl為0.4mol/L時(shí)最大),可能由于NaCl濃度為0.1～0.4mol/L時(shí)能促進(jìn)TGase對(duì)雞蛋蛋白的交聯(lián)作用形成分子量較大的蛋白;而當(dāng)NaCl濃度超過(guò)0.4mol/L時(shí),可能因樣品離子強(qiáng)度過(guò)高促使蛋白質(zhì)變性降低了TGase的活性[18],不利于TGase對(duì)雞蛋蛋白的作用,使樣品凝膠硬度和保水性緩慢下降。

圖2 NaCl濃度對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白凝膠的硬度和保水性的影響Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on the gel hardness and water holding capacity of egg white after TGase treatment

2.1.2 酶作用溫度對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 由圖3可知,隨TGase作用溫度的增加,樣品的凝膠硬度和保水性呈先升后降的趨勢(shì)(溫度為40℃時(shí)達(dá)到最大),這可能是溫度為25～50℃均有利于TGase對(duì)雞蛋蛋白的交聯(lián)作用形成分子量相對(duì)較大的蛋白,其中TGase對(duì)雞蛋蛋白作用的最適溫度為40℃,此時(shí)酶活性最大,對(duì)雞蛋蛋白交聯(lián)作用最佳;而溫度高于40℃時(shí)可能會(huì)使蛋白質(zhì)活性降低[19],影響TGase對(duì)雞蛋蛋白的交聯(lián)作用,因此樣品凝膠硬度和保水性下降。

圖3 溫度對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白凝膠的硬度和保水性的影響Fig.3 Effect of acting temperature on the gel hardness and water holding capacity of egg white after TGase treatment

2.1.3 pH對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 由圖4可知,樣品的凝膠硬度和保水性在pH為5.0～7.0時(shí)呈先升高后降低的趨勢(shì)(pH為6.0時(shí)達(dá)到最大),當(dāng)pH為7.0～7.5時(shí)呈增加趨勢(shì),這可能是由于pH在一定范圍內(nèi)有利于TGase對(duì)雞蛋蛋白的交聯(lián)作用形成分子量較大的蛋白,當(dāng)pH為6.0時(shí),TGase對(duì)雞蛋蛋白的作用最佳;當(dāng)pH為7.0時(shí),可能此時(shí)的pH本身有利于蛋白質(zhì)分散促進(jìn)交聯(lián)[13],而TGase使蛋白質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生交聯(lián),不利于形成較好的凝膠結(jié)構(gòu);當(dāng)pH超過(guò)7.0時(shí),可能是蛋白質(zhì)電荷增強(qiáng)[20],使熱凝結(jié)延緩了,在聚集前蛋白質(zhì)可完全舒展開(kāi),也可能是此時(shí)二硫鍵的作用開(kāi)始凸顯,且此時(shí)TGase的酶活雖然有所下降但依然可以促使雞蛋蛋白交聯(lián),使樣品凝膠硬度和保水性增加。

圖4 pH對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白凝膠的硬度和保水性的影響Fig.4 Effect of pH value on the gel hardness and water holding capacity of egg white after TGase treatment

2.1.4 酶作用時(shí)間對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 由圖5可知,雞蛋蛋白凝膠硬度和保水性隨作用時(shí)間的增加呈先升高后趨于平緩的趨勢(shì)(時(shí)間為4h時(shí)達(dá)到最強(qiáng))?？赡苁怯捎赥Gase在一定時(shí)間內(nèi)可促進(jìn)雞蛋蛋白交聯(lián)形成分子量相對(duì)較大的蛋白質(zhì),使樣品凝膠硬度和保水性顯著增強(qiáng);當(dāng)作用時(shí)間為4h時(shí)交聯(lián)作用達(dá)到飽和,繼續(xù)增加酶作用時(shí)間對(duì)其凝膠硬度和保水性影響不顯著。

2.1.5 TGase添加量對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白熱凝固性的影響 由圖6可知,雞蛋蛋白凝膠硬度和保水性隨TGase添加量的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)(TGase添加量為12U/g蛋白質(zhì)時(shí)達(dá)到最大)?？赡苁怯捎谶m量TGase能促使雞蛋蛋白交聯(lián)形成分子量相對(duì)較大的蛋白使樣品凝膠硬度和保水性顯著增強(qiáng);酶量為12U/g蛋白質(zhì)時(shí)TGase對(duì)雞蛋蛋白交聯(lián)作用最佳,但繼續(xù)添加TGase,可能會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)過(guò)度[13],降低了凝膠硬度和保水性。

圖5 酶作用時(shí)間對(duì)TGase處理的雞蛋蛋白凝膠的硬度和保水性的影響Fig.5 Effect of acting time on the gel hardness and water holding capacity of egg white after TGase treatment

圖6 TGase添加量對(duì)雞蛋蛋白凝膠的硬度和保水性的影響Fig.6 Effect of adding quantity of TGase on the gel hardness and water holding capacity of egg white after TGase treatment

2.2 TGase對(duì)雞蛋蛋白作用的SDS-PAGE電泳分析

2.2.1 不同TGase添加量處理的雞蛋蛋白SDS-PAGE電泳分析 由圖7可知,隨TGase量的增加,蛋白質(zhì)a、c、d均由清晰逐漸變得模糊或消失,可能是蛋白質(zhì)a、c、d均發(fā)生了分子間的交聯(lián)形成了分子量更大的蛋白質(zhì)分子團(tuán);當(dāng)TGase量為12U/g蛋白質(zhì)時(shí),蛋白質(zhì)a幾乎消失,蛋白質(zhì)c和蛋白質(zhì)d清晰度基本達(dá)到最低,可能是蛋白質(zhì)a已基本完全交聯(lián),蛋白質(zhì)c和d的交聯(lián)程度基本達(dá)到飽和。而隨TGase的增加,蛋白質(zhì)b由模糊逐漸變得清晰,可能是部分小分子蛋白交聯(lián)后形成了蛋白質(zhì)b,在酶量為12U/g蛋白質(zhì)時(shí)最清晰,表明此時(shí)小分子蛋白質(zhì)交聯(lián)程度達(dá)到飽和,繼續(xù)增加TGase量,蛋白質(zhì)b也逐漸變得模糊甚至消失,可能是由于蛋白質(zhì)b也因TGase的作用發(fā)生了交聯(lián),這與王然等[13]在TGase的研究中所得結(jié)果相似。

圖7 不同TGase添加量處理的雞蛋蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.7 The SDS-PAGE electrophoretogram of egg white treated by TGase in different TGase additive amount注:泳道1～6分別為TGase添加量是0、4、8、12、16、20U/g蛋白質(zhì)。

2.2.2 不同NaCl濃度下SDS-PAGE電泳分析 由圖8可知,隨著NaCl濃度的增加,蛋白質(zhì)a在NaCl濃度為0.2mol/L時(shí)消失;蛋白質(zhì)b條帶模糊幾乎不可見(jiàn);而蛋白質(zhì)c由清晰變得模糊在NaCl濃度為0.3mol/L時(shí)最模糊,隨后又略微增強(qiáng);蛋白質(zhì)d由模糊變得清晰,在NaCl濃度為0.4mol/L時(shí)清晰度最高,隨后又變模糊?？赡苁怯捎谠诘蜐舛萅aCl存在下,TGase能使蛋白質(zhì)a、c、d發(fā)生交聯(lián)形成大分子蛋白基團(tuán),而蛋白質(zhì)b可能是由于一些其它小分子蛋白在TGase作用下聚合而形成;當(dāng)NaCl濃度超過(guò) 0.4mol/L時(shí),可能是由于高離子強(qiáng)度條件下蛋白質(zhì)的變性[18],會(huì)影響TGase的活性,使TGase對(duì)蛋清中蛋白質(zhì)的作用減弱。

圖8 不同NaCl濃度下TGase處理的雞蛋蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.8 The SDS-PAGE electrophoretogram of egg white treated by TGase in different sodium chloride concentration注:泳道1～6分別為NaCl濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L。

2.2.3 不同作用溫度條件下SDS-PAGE電泳分析 由圖9可知,蛋白質(zhì)a在溫度為25℃時(shí)條帶最清晰,而在30～50℃時(shí)條帶逐漸模糊,其中45℃時(shí)最不清晰;蛋白質(zhì)b在溫度為25℃時(shí)條帶最不清晰,而隨溫度的增加其條帶逐漸變得清晰,在溫度為40℃時(shí)條帶最清晰,而溫度繼續(xù)增加其條帶又開(kāi)始模糊;蛋白質(zhì)c在溫度為25℃時(shí)條帶最清晰,而隨溫度的增加其條帶逐漸減弱,在溫度為45℃時(shí)條帶清晰度最低;蛋白質(zhì)d在溫度為25～40℃時(shí)由模糊變得清晰,45～50℃時(shí)又逐漸模糊。可能是由于TGase作用的最適溫度為40℃;而當(dāng)溫度高于40℃時(shí),可能是由于樣品中分子熱運(yùn)動(dòng)加劇[19],蛋白質(zhì)本身發(fā)生了聚合,因此在TGase的作用下出現(xiàn)了交聯(lián)過(guò)度。

圖9 不同作用溫度下TGase處理的雞蛋蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.9 The SDS-PAGE electrophoretogram of egg white treated by TGase in different acting temperature注:泳道1～6分別為作用溫度是25、30、35、40、45、50℃。

2.2.4 不同pH條件下SDS-PAGE電泳分析 由圖10可知,蛋白質(zhì)a在pH為5時(shí)條帶最清晰,pH5.5時(shí)條帶開(kāi)始變得模糊,在pH為6.0～7.5時(shí)條帶均不明顯;蛋白質(zhì)b在pH為5.0～6.0時(shí)條帶逐漸變得清晰,pH6.0～7.0時(shí)其條帶逐漸模糊,pH7.0時(shí)最不清晰,在pH為7.0～7.5時(shí)條帶有增強(qiáng)。蛋白質(zhì)c在pH為5.0時(shí)條帶最清晰,而pH為5.0～7.0時(shí)條帶逐漸模糊,7.0時(shí)最模糊,pH為7.0～7.5時(shí)條帶增強(qiáng);蛋白質(zhì)d在pH為5.0～7.0時(shí)條帶逐漸變得模糊,7.0時(shí)最模糊,7.0～7.5時(shí)條帶增強(qiáng)?？赡苁怯捎赥Gase對(duì)雞蛋蛋白作用的最適pH為6.0,此時(shí)TGase對(duì)雞蛋蛋白的作用最佳;而在pH為7.0時(shí),有利于蛋白質(zhì)分散,且此時(shí)酶活受pH影響而降低,不利于TGase對(duì)雞蛋蛋白的交聯(lián)作用;當(dāng)pH超過(guò)7.0時(shí),可能由于靜電作用[20],抑制了蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)聚集從而使得分子量相對(duì)較小的蛋白數(shù)量增加。

圖10 不同pH條件下TGase處理的雞蛋蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.10 The SDS-PAGE electrophoretogram of egg white treated by TGase in different pH value注:泳道1～6分別為pH是5、5.5、6、6.5、7.0、7.5。

2.2.5 不同TGase作用時(shí)間下SDS-PAGE電泳分析 由圖11可知,蛋白質(zhì)a在TGase作用時(shí)間為0h時(shí)條帶最明顯,而之后條帶逐漸變得不明顯;蛋白質(zhì)b在TGase作用時(shí)間為0h時(shí)條帶最不明顯,而時(shí)間的增加其條帶逐漸變得明顯,在作用時(shí)間為4h時(shí)條帶最明顯,而繼續(xù)增加作用時(shí)間其條帶又開(kāi)始逐漸減弱。蛋白質(zhì)c在TGase作用時(shí)間為0h時(shí)條帶最明顯,隨時(shí)間的增加其條帶逐漸減弱,在作用時(shí)間為4h時(shí)條帶清晰度明顯降低,繼續(xù)增加時(shí)間條帶仍有減弱但不顯著;蛋白質(zhì)d在TGase作用時(shí)間為0～3h時(shí)條帶變化不顯著,而在4～6h時(shí)其條帶開(kāi)始減弱,在6h時(shí)最弱?？赡苁怯捎赥Gase在一定時(shí)間內(nèi)可使雞蛋蛋白交聯(lián)形成分子量相對(duì)較大的蛋白質(zhì),當(dāng)作用時(shí)間為4h時(shí)交聯(lián)作用達(dá)到最大;但隨著作用時(shí)間的繼續(xù)增加,樣品可能會(huì)進(jìn)一步發(fā)生交聯(lián)[13],使分子量相對(duì)較小的蛋白質(zhì)進(jìn)一步減少。

圖11 不同酶作用時(shí)間作用后TGase處理的雞蛋蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.11 The SDS-PAGE electrophoretogram of egg white treated by TGase in different time注:泳道1～6分別為酶作用時(shí)間是0、1、2、3、4、5h。

因此,由以上SDS-PAGE電泳結(jié)果表明,TGase添加量、NaCl濃度、酶作用溫度、pH、酶作用時(shí)間這五個(gè)因素都會(huì)影響TGase對(duì)蛋清中蛋白質(zhì)的作用。在一定的條件范圍內(nèi)可促進(jìn)TGase對(duì)雞蛋蛋白的交聯(lián)作用形成分子量相對(duì)較大的分子基團(tuán),而在一定條件下不利于TGase對(duì)雞蛋蛋白的交聯(lián)作用。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1),每個(gè)樣品設(shè)定三個(gè)重復(fù),以蛋白凝膠的硬度和保水性作為分析指標(biāo),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析見(jiàn)表3和表4。

表3 硬度方差分析表Table 3 Variance analysis of gel hardness

注:**表示極顯著(p<0.01)。

通過(guò)表2中極差分析可知,TGase對(duì)雞蛋蛋白凝膠硬度影響的各因素先后順序?yàn)?E>D>C>B>A,對(duì)蛋白凝膠保水性影響的順序?yàn)镋>D>C>A>B,且由表3和表4可知,各因素對(duì)TGase處理后蛋白凝膠的硬度和保水性影響極顯著(p<0.01)。由表2中K和K′值可知,硬度和保水性最佳的組合均為A2B2C1D2E3,此結(jié)果與單因素實(shí)驗(yàn)所得最佳硬度和保水性組合均為A3B2C2D3E3的結(jié)果不一致,可能是由于各因素水平之間的相互影響導(dǎo)致結(jié)果有一定的差異。且正交實(shí)驗(yàn)組中硬度和保水性最大組均為A2B2C1D4E3,因此有必要對(duì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 2 Results analysis of orthogonal experiment

表4 保水性方差分析表Table 4 Variance analysis of water holding capacity

注:**表示極顯著(p<0.01)。

表5 硬度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 5 Results of gel hardness confirmatory experiment(n=3)

表6 保水性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 6 Results of water holding capacity confirmatory experiment(n=3)

由表5和表6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,TGase對(duì)雞蛋蛋白作用使其熱誘導(dǎo)形成凝膠硬度最佳的組合為A2B2C1D2E3,即酶作用溫度35℃,pH為6.00,TGase添加量為10U/g蛋白質(zhì),作用時(shí)間為3.5h,NaCl濃度為0.4mol/L,受熱凝固所得凝膠硬度最大約為(134.73±1.79)g,保水性最高約為93.83%±0.58%,RSD分別為1.33%和0.62%,表明該優(yōu)化條件穩(wěn)定性好,正交實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證。

3 結(jié)論

3.1 TGase可使雞蛋蛋白發(fā)生交聯(lián),改善雞蛋蛋白的熱凝固性,從而顯著提高其凝膠的硬度和保水性。

3.2 TGase對(duì)雞蛋蛋白熱凝固性影響的最佳條件為:酶作用溫度35℃,pH為6.00,TGase添加量為10U/g蛋白質(zhì),酶作用時(shí)間為3.5h,NaCl濃度為0.4mol/L。該條件下雞蛋蛋白凝膠的硬度最大達(dá)到(134.73±1.79)g,保水性為93.83±0.58%,比空白組分別提高了58.87%和29.38%。

3.3 通過(guò)SDS-PAGE電泳分析得出:TGase添加量、NaCl濃度、酶作用溫度、pH、酶作用時(shí)間這五個(gè)因素都會(huì)影響TGase對(duì)蛋清中蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用,從而影響雞蛋蛋白的熱凝固性;TGase對(duì)蛋清中蛋白質(zhì)作用的最適TGase添加量為12U/g蛋白質(zhì)、最適NaCl濃度為0.4mol/L、最適酶作用溫度為40℃、最適pH為6.00以及最適酶作用時(shí)間為4h,而這與正交實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論(酶作用溫度35℃,TGase添加量為10U/g蛋白質(zhì),作用時(shí)間為3.5h)存在一定差異,這可能是由于TGase作用于雞蛋蛋白時(shí)受到酶作用溫度、酶作用時(shí)間和酶添加量之間的交互作用,從而導(dǎo)致SDS-PAGE電泳所得結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果存在一定差異。

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Effect of transglutaminase on the heat coagulation of egg white

LEI Ming-hui,YE Jin-song*,ZHANG Ming-rong,LI Zhi,LI Rui,XIAO Meng,ZHANG Zi-li,LI Xin-yang,ZHENG Bo-hong

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

The effect of sodium chloride concentration,pH,enzyme acting temperature,time and its adding amount on the gel hardness and water holding capacity of egg white treated by transglutaminase were studied in this experiment. The SDS-PAGE electrophoresis was used to analyze the protein crosslinking after enzyme treatment to explore the mechanism of transglutaminase on heat coagulation of egg white. The results showed that the gel hardness and water holding capacity of egg white was increased significnatly after TGase treatment(p<0.01).When sodium chloride concentration was 0.4mol/L,pH was 6.0,temperature was 35℃,acting time was 3.5h and the TGase addition was 10U/g protein,the value of gel hardness and water holding capacity of egg white reached their maximum value of(134.73±1.79)g and 93.83%±0.58%,which were 58.87% and 29.38% higher than that of control group,respectively. The SDS-PAGE electrophoresis analysis showed:TGase could contribute to the crosslinking of protein molecules in egg white under certain conditions,which improved the heat coagulation of egg white.

transglutaminase;egg white;heat coagulation

2014-08-06

雷明輝(1988-)，男，碩士，研究方向：蛋品貯藏及加工。

*通訊作者:葉勁松(1967-)，男，碩士，副教授，研究方向：蛋品貯藏及加工。

TS253.2

A

1002-0306(2015)13-0143-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.021