戴 榕,孔得信,李宗羽,包向男,郭小華,劉 虹

(中南民族大學,南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護與綜合利用工程中心,湖北武漢 430074)

山藥黏蛋白的兩種提取工藝及其對食道癌細胞的抑制

戴 榕,孔得信,李宗羽,包向男,郭小華,劉 虹*

(中南民族大學,南方少數(shù)民族地區(qū)生物資源保護與綜合利用工程中心,湖北武漢 430074)

本實驗以恩施州紅細毛山藥為實驗材料,探索了從山藥全粉中提取山藥黏蛋白的工藝,比較了酶解絮凝法和傳統(tǒng)的水提醇沉法兩種工藝的優(yōu)劣,并研究了山藥黏蛋白對人食道癌細胞EC-109的抑制作用。實驗結(jié)果如下:水提醇沉法最高得率為1.98%,最適料液比為1∶25、浸提溫度45℃、浸提時間2h;酶解絮凝法得率最高達4.25%,絮凝時最適pH為9、殼聚糖最適濃度為10g/L。利用提取的山藥黏液蛋白作用于人食道癌細胞EC-109的實驗結(jié)果表明,五種稀釋濃度的黏液蛋白對腫瘤細胞均有一定的抑制效果,在200倍稀釋情況下,對EC-109的抑制作用最明顯。

山藥黏液蛋白,提取工藝,食道癌細胞

山藥為薯預科植物薯蕷(Dioscorea opposita),屬多年生纏繞草木植物,又名山芋、蘋茹,藥食兩用,塊莖富含山藥黏液蛋白[1]。黏蛋白是目前公認的山藥主要有效成分,也是山藥化學和藥理研究的重點和熱點[2]。山藥黏液蛋白的組成和結(jié)構(gòu)比較復雜,與山藥多糖組成蛋白-多糖復合體[3]。山藥黏液蛋白具有抗氧化、抗衰老、抗突變作用,能夠降低血糖、調(diào)節(jié)免疫功能和抗腫瘤,具有預防心血管系統(tǒng)脂肪沉淀、保持血管彈性、防止動脈粥樣硬化等功效,并能減少皮下脂肪沉淀,避免人體出現(xiàn)肥胖[4-6],因此,山藥黏液蛋白質(zhì)對冠心病患者極為有益。山藥黏液蛋白具有熱不穩(wěn)定性,與多糖的分離比較困難。國內(nèi)外對山藥黏液蛋白的提取進行了廣泛研究[7-10],但很少研究成果能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,多停留在實驗室階段,且存在有機溶劑殘留量大、多糖得率低和成本高等問題,如傳統(tǒng)的多糖提取水提醇沉法[11]。如何采用先進技術(shù)、低成本、高效產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)黏液蛋白成為山藥產(chǎn)品開發(fā)的關(guān)鍵問題。

本研究采用傳統(tǒng)的水提醇沉法和酶解絮凝法兩種不同工藝,從恩施州本土山藥品種紅細毛山藥全粉中快速提取山藥黏液蛋白。在比較了兩種工藝優(yōu)劣的基礎(chǔ)上,進行了四因素四水平正交分析,探索了山藥黏液蛋白的高效提取技術(shù)。食道癌是常見和危害性極嚴重的惡性腫瘤之一,世界各國均有發(fā)現(xiàn)且呈區(qū)域性高發(fā),目前正嚴重威脅著人類的健康[12-13]。在獲得黏液蛋白凍干粉以后,我們驗證了山藥黏蛋白對人食管癌細胞EC-109的抑制作用,在癌癥高發(fā)生率的21世紀,山藥黏蛋白的抗癌作用無疑可以極大的提高該工藝的商業(yè)價值,幫助此工藝推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥全粉 恩施州湖北匯龍食品有限責任公司提供;人食管癌細胞EC-109系 湖北省腫瘤醫(yī)院提供;食品級殼聚糖 購自武漢祥和精細化工有限公司;高溫α-淀粉酶 購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠,活力單位3000-5000,CM:02-42;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清 均購自于BD公司。

FA1004電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;HHW21.600型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司;101-OAB型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;L2S紫外分光光度計 上海儀電儀器分析總廠;FD-ID-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;AVANTI J-E高速離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離蛋白的提取工藝流程 水提醇沉法:山藥粉過篩→浸提→離心分離→收集上清→異丙醇沉淀→離心分離→收集沉淀→真空干燥→山藥黏液蛋白。

酶解絮凝法:山藥粉過篩→浸提糊化→酶解→靜置沉淀→收集上清→pH調(diào)整→殼聚糖絮凝→靜置沉淀→收集沉淀→真空干燥→山藥黏液蛋白。

1.2.2 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定

1.2.2.1 水提醇沉法 浸提料液比、浸提溫度、浸提時間的實驗因素水平設(shè)計見表1。每個實驗組合均稱取100目過篩后的山藥全粉100g,采用5種不同料液比,45℃提取2h;采用5種不同溫度,料液比1∶15g/mL,浸泡2h;料液比1∶25g/mL,45℃下浸泡不同時間。然后6000×g離心10min,收集上清;在上清液中加入3倍體積的異丙醇,連續(xù)攪拌30min,靜止過夜后,重復上一離心步驟,收集沉淀,真空冷凍干燥并稱重,計算山藥黏蛋白得率[11]。每組實驗重復三次,根據(jù)得率的高低選擇最佳浸提料液比、浸提溫度和浸提時間參數(shù)。

表1 實驗因素水平設(shè)計表Table 1 Level design of experimental factors

1.2.2.2 酶解絮凝法 酶解過程:稱取山藥全粉1kg,100目過篩后,加30L 1%的氯化鈉溶液,邊加熱邊攪拌,升溫至60℃并維持攪拌2h;按照50g的山藥全粉中加入0.5g高溫α-淀粉酶的比例[8],加入時樣品仍保持在恒溫水浴鍋中,繼續(xù)攪拌1h,使黏液蛋白充分溶出;室溫條件下自然沉降,選取含有黏液蛋白的上清溶液(即發(fā)酵液)備用。

絮凝最適pH的確定:在1000mL三角瓶中,分別取250mL發(fā)酵液,調(diào)節(jié)pH至4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,各加入10g/L殼聚糖溶液溶液,使其終濃度分別為1.0g/L,恒溫搖床200r/min震蕩5min,倒入50mL沉降試管(3.4cm × 14cm),室溫靜止60min,去上清,收集沉淀,5000r/min離心5min,并將沉淀在60℃烘干至恒重,棄上清,收集沉淀真空冷凍干燥后稱重,計算山藥黏蛋白得率。每個實驗重復三次。

殼聚糖濃度的確定:在絮凝最適pH確定后,添加殼聚糖至發(fā)酵液中,使溶液終濃度分別為0.2,0.4,0.6,0.8,1.0g/L,其余操作同上,收集沉淀真空冷凍干燥后稱重,計算山藥黏蛋白得率,根據(jù)得率大小選取最適的殼聚糖添加量。每個實驗重復三次。

1.2.2.3 黏液蛋白提取率的測定 兩種不同提取方法獲得山藥粘蛋白沉淀后,在-60℃進行真空冷凍干燥,真空4～5Pa持續(xù)24h。山藥黏液蛋白得率(%)=黏液蛋白總蛋白質(zhì)量/原料總質(zhì)量×100。

1.2.3 山藥黏液蛋白對人食管癌細胞EC-109的抑制及顯微觀察 人食管癌細胞EC-109的培養(yǎng):細胞貼壁生長后,置于含體積比10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)箱CO2濃度為5%(體積比),37℃培養(yǎng),3～4d傳代1次,取對數(shù)期生長的細胞用于實驗。

收集真空冷凍干燥后的山藥黏液蛋白,用50mmol/L的磷酸緩沖液將山藥黏蛋白干粉稀釋成5種不同濃度的黏蛋白溶液(0.005、0.0025、0.00167、0.00125、0.001mg/mL),各取100μL,分別作用于100μL培養(yǎng)好的對數(shù)期人食管癌細胞EC-109(3×103個細胞),每隔12h取樣,用MTT法測得490nm處吸光值。用100μL無菌水作用于等體積的人食管癌細胞EC-109作為空白對照,并計算不同濃度的山藥黏液蛋白溶液在各個時間內(nèi)對癌細胞的抑制率,癌細胞生長抑制率根據(jù)公式IR(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100來計算。每個實驗重復五次。

黏蛋白溶液作用于人食管癌細胞EC-109 72h后,取不同處理組細胞及對照組細胞常規(guī)制片,置于普通光學顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞生長形態(tài)。

1.2.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS19.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理,結(jié)果以(x±s)表示,兩組間均數(shù)比較用t檢驗,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以p<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 水提醇沉法

2.1.1 料液比對山藥黏液蛋白得率的影響 5種浸提料液比對山藥黏液蛋白得率的影響結(jié)果見圖1。由圖可知,隨著料液比的逐步增大,得率逐步上升,在料液比1∶25g/mL時,山藥黏液蛋白得率最高,接近2%。但是料液比為1∶30g/mL時,山藥黏液蛋白得率有下降趨勢,這可能是由于過高的料液比使得溶液粘稠度增大,得率下降。1∶25g/mL的料液比為浸提最適料液比。

圖1 浸提料液比對山藥黏液蛋白得率的影響Fig.1 Influence of extracting water-material ratio on the yield of yam mucus protein

2.1.2 浸提溫度對山藥黏液蛋白得率的影響 5種浸提溫度對山藥黏液蛋白得率的影響結(jié)果見圖2。由圖可知,45℃時,山藥黏液蛋白得率最高,達到1.5%,45℃為浸提提取最適溫度。

圖2 浸提溫度對山藥黏液蛋白得率的影響Fig.2 Influence of extracting temperature on the yield of yam mucus protein

2.1.3 浸提時間對山藥黏液蛋白得率的影響 5種浸提時間對山藥黏液蛋白得率的影響結(jié)果見圖3。由圖可知,浸提時間在2h以前,隨著時間的延長得率明顯增加,2h以后的得率雖然有增加趨勢,但幾乎保持在同一直線,從經(jīng)濟節(jié)約角度考慮,擬定浸提時間2h為最適浸提時間。

圖3 浸提時間對山藥黏液蛋白得率的影響Fig.3 Influence of extracting time on the yield of yam mucus protein

2.2 酶解絮凝法

2.2.1 絮凝pH的確定 如圖4所示,酶解絮凝中上清液的pH在4至9時,隨著pH的升高,山藥黏液蛋白的得率顯著提高,在pH為9時黏液蛋白的得率最高,達到3.95%,pH進一步升高時得率呈下降趨勢,分析其原因可能是pH的變化使山藥黏液蛋白的電荷屬性發(fā)生變化,影響了黏蛋白與殼聚糖的結(jié)合,導致山藥黏液蛋白得率下降。從實驗結(jié)果可知,酶解絮凝最適pH為9。

圖4 pH對山藥黏液蛋白得率的影響Fig.4 Influence of pH on the yield of yam mucus protein

2.2.2 殼聚糖濃度的確定 發(fā)酵液中五種不同濃度的殼聚糖添加量對山藥黏液蛋白得率的影響如圖5所示。由實驗結(jié)果可知,發(fā)酵液中殼聚糖添加的最適宜濃度為0.8g/L,濃度為1.0g/L時得率呈下降趨勢,分析其原因可能是殼聚糖添加過量后體系黏度隨著增加,降低了分子間的接觸能力,導致得率降低[14]。

圖5 發(fā)酵液中殼聚糖的濃度對黏液蛋白得率的影響Fig.5 Influence of chitosan on the yield of yam mucus protein

2.3 兩種提取方法的統(tǒng)計學分析及最佳參數(shù)的確定

從表2,表3可知,水提醇沉和酶解絮凝兩種提取方法中,料液比、浸提溫度、浸提時間、絮凝pH、殼聚糖終濃度這五個因素的p值均小于0.01,表明料液比、浸提溫度、浸提時間、絮凝pH、殼聚糖終濃度對山藥黏蛋白的得率有極顯著影響。

表2 水提醇沉法的因素方差分析表Table 2 ANOVA table of the method of water extraction and alcohol precipitation

注:**表示極顯著(p<0.01),表3同。

表4 山藥提取物對EC-109癌細胞的抑制率的方差分析表Table 4 Variance table of yam mucus protein to EC-109 cancer cell

注:**表示極顯著(p<0.01),R2=0.964。

進一步進行LSD法分析,通過方差分析表與LSD法相結(jié)合,最終確定兩種工藝提取山藥黏液蛋白的最適參數(shù)如下:水提醇沉法,料液比1∶25g/mL、浸提溫度45℃、浸提時間2h,最高得率為1.98%;酶解絮凝法的最適宜提取參數(shù)為:pH為9,發(fā)酵液中殼聚糖添加的最適宜濃度為0.8g/L,最高得率為4.25%。

表3 酶解絮凝法的因素方差分析表Table 3 ANOVA table of the method of Enzymatic degradation and flocculation

2.4 山藥黏液蛋白對人食管癌細胞EC-109的抑制

圖6 不同濃度山藥提取物對EC-109癌細胞的抑制效果Fig.6 Effect of different dilution Yam mucus protein to EC-109 cancer cell注:對照組抑制效率為0。

五種不同稀釋濃度的山藥提取物黏蛋白溶液對人食管癌細胞EC-109的抑制效果如圖6、圖7所示,統(tǒng)計分析結(jié)果見表4。從圖6結(jié)果可以看出,在作用時間48h以內(nèi),山藥黏液蛋白的濃度越高,對食管癌細胞的抑制作用越強,48h后抑制效果趨于平緩,72h后接近臨界值最高峰(數(shù)據(jù)未給出)。從黏液蛋白稀釋液作用后癌細胞的細胞形態(tài)來看(圖7),結(jié)果與圖6一致,稀釋倍數(shù)越低癌細胞降解死亡程度越高。五種溶液中,最高濃度的山藥黏液蛋白溶液(0.005mg/mL)對食管癌細胞的抑制效果較好,說明在一定濃度范圍內(nèi),山藥黏液蛋白濃度越高,作用時間越長,對人食管癌細胞EC-109的抑制效果越明顯。從表4可知,山藥黏液蛋白不同稀釋倍數(shù)和不同處理時間均對癌細胞生長的抑制率有極顯著的影響,且影響程度大小順序為:稀釋倍數(shù)>處理時間。

圖7 五種不同濃度的山藥黏蛋白溶液處理72h后的EC-109癌細胞形態(tài)Fig.7 Influence of five different cancer cells solution to EC-109 cancel cell after72 hours注:稀釋濃度(mg/mL)為A. 0.005mg/mL、B. 0.0025mg/mL、C. 0.00167mg/mL、D. 0.00125mg/mL、E. 0.001mg/mL;F為EC-109癌細胞對照;標尺=50μm。

3 結(jié)論

本實驗探索兩種從山藥全粉中提取山藥黏蛋白的加工工藝,利用提取的山藥黏蛋白研究了該粗蛋白對人食管癌細胞EC-109的抑制作用。兩種提取工藝的最適提取參數(shù)分別如下,水提醇沉法:料液比1∶25g/mL、浸提溫度45℃、浸提時間2h,最高得率為1.98%;酶解絮凝法的最適宜提取參數(shù)為:pH為9時,發(fā)酵液中殼聚糖添加的最適宜濃度為0.8g/L,最高得率達4.25%。比較兩種提取方法可以發(fā)現(xiàn)酶解絮凝法的得率明顯高出水提醇沉法,我們建議采用的酶解絮凝法替代了傳統(tǒng)的水提醇沉法工藝。因為在實際生產(chǎn)中,水提醇沉法需要反復采用有機溶劑提取,不僅存在有機溶劑殘留的問題,不利于山藥渣的回收利用,而且增加了生產(chǎn)成本和安全風險。酶解絮凝法則在較溫和的條件下采用自然沉降的方式固液分離沉淀山藥黏液蛋白,極大的提高了生產(chǎn)效率和安全性,是一種資源節(jié)約型和環(huán)境友好型工藝。酶解絮凝的優(yōu)點在于不存在有機溶劑廢液污染問題,利用自然沉降的方式來實現(xiàn)固液分離,步驟簡單降且低了生產(chǎn)成本,并且得到的成品不含對人體有害的物質(zhì),后續(xù)處理方便。殘存的殼聚糖本身作為一種天然的食品添加劑,還具有一定的抗菌防腐的作用,大大促進了山藥粘蛋白粉的推廣應(yīng)用。

利用山藥多糖的抗腫瘤研究在國內(nèi)外有過許多報道[6,15-16],但對山藥黏液蛋白作用于人食管癌細胞的研究仍為空白。本實驗研究發(fā)現(xiàn)山藥黏液蛋白對人食管癌細胞EC-109有較好的抑制作用,在一定的稀釋范圍內(nèi),黏液蛋白濃度越高,對食管癌細胞的抑制作用越明顯。本研究結(jié)果為抗腫瘤藥物的篩選奠定了基礎(chǔ),也拓寬了新的思路。

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Comparison of two extraction technology of Yam mucus proteinand its inhibition on Esophageal cancer cells

DAI Rong,KONG De-xin,LI Zong-yu,BAO Xiang-nan,GUO Xiao-hua,LIU Hong*

(Engineering Research Centre for the Protection and Utilization of Bioresource in Ethnic Area ofSouthern China,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China)

In this paper,local hongximao yam in Enshi was used to extract Yam mucus protein as experimental material. Two kinds of extraction methods were compared. The inhibition of Yam mucus protein to human esophageal cancer cell EC-109 was also studied. Result showed that the highest yield of the traditonal method with water extraction and alcohol precipitation was 1.98%,the optimum solid-liquid ratio was 1∶25,the optimum extraction temperature was 45℃ and the optimum extraction time was two hours. The highest yield of the method enzymatic flocculation was 4.25%. The optimum pH of the flocculation process was 9 and the optimum concentration of chitosan was 10g/L. Result of anticancer experiment showed that five solutions of mucus protein with different dilutions all had a certain inhibition on the tumor cells. The effect of the solution with 200-fold dilution to EC-109 cancer cells was the best.

Yam mucus protein;extraction technology;Esophageal cancer cell

2014-09-04

戴榕(1993-)，女，本科,研究方向：微生物。

*通訊作者:劉虹(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：植物資源學。

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練項目(BCX13103)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)13-0371-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.070