陳 默，金曉霞，于麗杰，朱 宏，丁國華，傅文上，付 暢

(1 哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150025；2 密山市第一中學(xué)，黑龍江密山 158300)

番茄LeRma1基因的克隆與表達(dá)

陳 默1,2，金曉霞1*，于麗杰1，朱 宏1，丁國華1，傅文上1，付 暢1

(1 哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150025；2 密山市第一中學(xué)，黑龍江密山 158300)

以番茄‘哈大粉801’為試材，利用RT-PCR技術(shù)，克隆得到1個(gè)E3泛素蛋白連接酶基因LeRma1(GenBank登錄號(hào)XM_004243764.1)。對LeRma1基因進(jìn)行序列分析，并對LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物脅迫(干旱、鹽、堿、高溫、低溫)下的表達(dá)和生理特性進(jìn)行研究，為培育和改良番茄品種提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：(1)序列分析顯示，LeRma1基因的cDNA全長序列729 bp，編碼242個(gè)氨基酸，分子量為27.05 kD，理論pI 7.97；同源分析顯示，番茄LeRma1蛋白與馬鈴薯的一致性最高(91%)。(2)半定量PCR檢測表明，LeRma1基因在番茄根、莖、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)，且表達(dá)差異不明顯。(3)干旱脅迫下，LeRma1基因在番茄葉片中優(yōu)勢表達(dá)，而在整個(gè)干旱過程中根部的LeRma1基因表達(dá)量變化不明顯；抗旱相關(guān)基因LEA、DREB2A、ABI3在干旱脅迫過程中，番茄葉片中均有表達(dá)，且其表達(dá)量呈上升趨勢，而在根部DREB2A、ABI3基因基本沒有檢測到。(4)干旱脅迫過程中，番茄植株中丙二醛(MDA)含量呈顯著升高趨勢，質(zhì)膜系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷，體內(nèi)保護(hù)酶(SOD、POD、CAT)活性上升，且根部活性總體明顯高于葉片。(5)在非生物逆境(鹽、堿、高溫、低溫)脅迫過程中，LeRma1基因在番茄葉片和根部的表達(dá)幾乎都有增強(qiáng)的趨勢，且在葉片中均是脅迫3 h后誘導(dǎo)起始增強(qiáng)表達(dá)。研究認(rèn)為，LeRma1基因是一個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的基因，且在葉片中優(yōu)勢表達(dá)，說明LeRma1基因?qū)χ参锬褪芨珊得{迫所起的作用存在一定的組織差異性，而且LeRma1基因可能參與番茄的干旱應(yīng)答及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在番茄抵抗其他非生物脅迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。

番茄；LeRma1；克??；表達(dá)

植物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)常遭遇到生物和非生物脅迫的傷害。在各種非生物脅迫中，干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫對植物的影響尤為突出，是制約植物生長和農(nóng)作物產(chǎn)量的最主要非生物脅迫因子[1-2]。番茄(LycopersiconesculentumMill.)是重要的經(jīng)濟(jì)作物，然而干旱環(huán)境嚴(yán)重影響了番茄的生長發(fā)育和產(chǎn)量[3-7]。因此，如何提高番茄對干旱脅迫的抗性以及通過分子生物學(xué)手段改良番茄抗逆性、培育相關(guān)新品種，已成為中國乃至世界農(nóng)業(yè)能否持續(xù)高效發(fā)展的重大課題之一[8-10]。

E3泛素蛋白連接酶(ubiquitin-protein ligases，E3s)是泛素/26S蛋白酶體途徑[11]中負(fù)責(zé)與底物蛋白特異結(jié)合的關(guān)鍵酶,它可以通過泛素化降解與脅迫信號(hào)有關(guān)的成分來響應(yīng)對各種非生物的脅迫[12-13]，通過其對無功能蛋白的降解，在植物抗逆中發(fā)揮著重要作用。Lee等[14]從辣椒中分離出一個(gè)RING-finger類型[15]E3連接酶CaRma1H1，在擬南芥中異源過表達(dá)Rma1H1明顯增強(qiáng)了植物對干旱的耐受性，說明Rma1H1基因正調(diào)控植物的干旱脅迫響應(yīng)過程。Bae等[16]報(bào)道,辣椒Rma1H1在水稻中的同源蛋白OsRDCP1參與對水稻干旱脅迫響應(yīng)過程的正調(diào)控，但是其具體作用機(jī)制仍不清楚。同樣，Seo等[17]從辣椒中獲得CaRma1H1，并發(fā)現(xiàn)其在番茄中異源過表達(dá)與野生型相比可以極大增強(qiáng)其對干旱脅迫的耐性。

盡管在其他植物中已有部分關(guān)于E3連接酶Rma1的研究，但在番茄中的Rma1基因至今尚未報(bào)道。本研究根據(jù)已有的基因序列數(shù)據(jù)庫資源，同源克隆出番茄的LeRma1基因cDNA全長，在對其進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測的基礎(chǔ)上，分析LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及干旱脅迫處理下的表達(dá)情況，并對脅迫過程中的生理特性進(jìn)行研究，為番茄改良和培育抗旱品種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試材料為哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院‘哈大粉801’番茄(LycopersiconesculentumMill.)，五葉期(根、葉)、成株期(根、莖、葉、花、果實(shí))取材于哈爾濱師范大學(xué)植物培養(yǎng)室。

采用草炭土育種，當(dāng)番茄長出子葉時(shí)，移植于6 cm×7 cm的小缽里。當(dāng)植株長至5葉期時(shí)，取番茄葉片用于基因克隆。五葉期番茄進(jìn)行干旱控水處理，分別于處理后0、1、3、6、8、10 d和復(fù)水后1 d取根和成熟葉，用于半定量表達(dá)分析與番茄植株部分生理指標(biāo)的測定。干旱處理后0、3、6、10 d和復(fù)水后1 d取根和成熟葉，用于熒光定量表達(dá)分析。五葉期番茄進(jìn)行鹽(200 mmol/L NaCl)、堿(100 mmol/L Na2CO3)、高溫(40 ℃)、低溫(4 ℃)脅迫處理，并取脅迫后0、3、6、12和24 h幼苗的根部和葉片，用于半定量表達(dá)分析。取番茄成株不同部位(根、莖、葉、花、果實(shí))用于基因的組織器官表達(dá)分析。以上材料均用錫箔紙包好后迅速用液氮冷凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 對以上材料進(jìn)行總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成，具體方法參照RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)操作程序進(jìn)行。

1.2.2 番茄LeRma1基因cDNA序列克隆和PCR反應(yīng)體系 以辣椒的Rma1H1的cDNA序列為信息，與已公布的番茄基因組序列(http://gkcsuja.solgenomics.net/tools/blast/)進(jìn)行比對，獲得編號(hào)為Solyc07g054080.1的基因序列，根據(jù)這個(gè)基因cDNA序列信息設(shè)計(jì)特異引物L(fēng)1和L2(表1)。以葉片cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為模板cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl22.5 μL，dNTP Mixture(2 mmol·L-1)2.5 μL，TaqDNA聚合酶(5U·μL-1)0.2 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共進(jìn)行35個(gè)反應(yīng)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。電泳回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂板篩選白色克隆，菌液PCR和雙酶切初步鑒定后送上海生工公司測序。

1.2.3 序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序分析蛋白質(zhì)的開放讀碼區(qū)。應(yīng)用SignaIP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/)預(yù)測蛋白的信號(hào)肽。利用在線軟件TMpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對蛋白進(jìn)行跨膜分析。應(yīng)用PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)在線蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測網(wǎng)站對蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。應(yīng)用在線網(wǎng)站http://www.expasy.org/prosite/預(yù)測蛋白質(zhì)具有生物學(xué)意義的位點(diǎn)、模式和輪廓。其他植物的Rma1蛋白序列均來自于NCBI數(shù)據(jù)庫，使用BLAST進(jìn)行序列比對。先用軟件DNAMAN對序列進(jìn)行多重比對，然后用軟件MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4LeRma1基因在番茄不同器官中的表達(dá) 根據(jù)LeRma1基因的cDNA序列設(shè)計(jì)半定量表達(dá)引物L(fēng)3和L4(表1)。提取番茄成株不同部位(根、莖、葉、花、果實(shí))的RNA，去除DNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測定cDNA濃度，使各自濃度一致，然后進(jìn)行半定量RT-PCR。模板分別為不同組織的cDNA 1 μL，引物L(fēng)3和L4(10 μmol·L-1)各1 μL，PCR體系同1.2.2，退火溫度58 ℃。同時(shí)以β-Actin基因作為內(nèi)參，用β-Actin引物(表1)對其進(jìn)行擴(kuò)增。

表1 引物名稱及序列Table 1 Names and sequences of the primers

1.2.5 干旱脅迫下LeRma1和其他抗旱相關(guān)基因的表達(dá)分析 干旱處理后0、1、3、6、8、10 d和復(fù)水后1 d取根部和葉片，用于LeRma1和其他抗旱相關(guān)基因(DREB2A、ABI3、LEA)半定量表達(dá)分析，方法同1.2.4。

1.2.6 干旱脅迫下LeRma1基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析 分別提取番茄五葉期干旱處理0、3、6、10 d和復(fù)水后1 d的根和葉的RNA，去除DNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測定cDNA濃度，使其濃度一致，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，以β-Actin基因作為內(nèi)參(表1)。

反應(yīng)體系為PCR Master Mix-Plus- 25 μL，Plus solution 5 μL， 10 μmol·L-1L3和L4引物(表1)各2 μL，模板cDNA 5 μL，加入雙蒸水至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸35 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光 PCR儀(Applied Biosystems Co.Ltd.，USA)上進(jìn)行，采用兩步法，在60 ℃進(jìn)行熒光信號(hào)采集，反應(yīng)結(jié)束后繪制融解曲線。樣本和內(nèi)參分別設(shè)3個(gè)重復(fù)，β-Actin為內(nèi)參(表1)。采用比較CT法(ΔΔCT)熒光定量PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以干旱脅迫0 d的根和葉為對照樣品。

1.2.7 干旱脅迫下番茄植株生理指標(biāo)測定 以五葉期番茄植株干旱處理0、1、3、6、8、10 d和復(fù)水后1 d的根和葉為材料，進(jìn)行丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性(POD、CAT、SOD)的測定。

丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[18]。過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[19]，以每克鮮重每分鐘A470變化0.01的酶量為一個(gè)酶活性單位。過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法[19]，以每克鮮重每分鐘A240光密度降低0.1的酶量為一個(gè)酶活性單位。超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑光還原法[19]，以每克鮮重抑制NBT光化學(xué)還原50%為一個(gè)酶活性單位。以上試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.2.8 鹽、堿、高溫、低溫脅迫下LeRma1基因的表達(dá)分析 對五葉期番茄進(jìn)行鹽(200 mmol/L NaCl)、堿(100 mmol/L Na2CO3)、高溫(40 ℃)、低溫(4 ℃)脅迫處理，并取脅迫后0、3、6、12、24 h幼苗的根部和葉片，用于半定量表達(dá)分析，方法同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄LeRma1基因cDNA序列的獲得

以番茄葉片的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條約750 bp左右的條帶(圖1)。將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，涂板篩選白色克隆，菌液PCR后進(jìn)行雙酶切(圖2)，得到目的條帶。

圖1 LeRma1基因全長cDNA序列擴(kuò)增結(jié)果

圖2 pMD18T-LeRma1雙酶切電泳

2.2LeRma1基因的序列分析

應(yīng)用NCBI的ORF Finder程序顯示開放讀碼區(qū)為729 bp，編碼242個(gè)氨基酸(圖3)。對番茄LeRma1蛋白氨基酸組成分析，242個(gè)氨基酸中有18個(gè)強(qiáng)負(fù)極性氨基酸(D、E)，20個(gè)強(qiáng)正極性氨基酸(K、R)，6個(gè)弱堿性氨基酸(H)，94個(gè)疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V、P、M)，104個(gè)極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y、G)；其分子量為27.05 kD，理論pI為7.97。預(yù)測LeRma1蛋白信號(hào)肽發(fā)現(xiàn)，番茄LeRma1蛋白質(zhì)不含有信號(hào)強(qiáng)烈的信號(hào)肽。

對番茄LeRma1蛋白進(jìn)行跨膜分析表明，按膜的取向來分，由內(nèi)向外有3個(gè)顯著的跨膜螺旋，由外向內(nèi)有3個(gè)明顯的跨膜螺旋。對番茄LeRma1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由loop環(huán)(78.9%)、α螺旋(19.0%)構(gòu)成，此外還有少量的β折疊(2.1%)。應(yīng)用在線網(wǎng)站http://www.expasy.org/prosite/預(yù)測番茄LeRma1蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義的位點(diǎn)、模式和輪廓，發(fā)現(xiàn)該蛋白在37～86氨基酸殘基處有1個(gè)RING-type鋅指蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)。

采用BlastX分析番茄LeRma1氨基酸序列與GenBank中其他植物的Rma1蛋白的同源關(guān)系，蛋白氨基酸序列分析結(jié)果(圖4)表明，番茄LeRma1氨基酸序列與馬鈴薯的一致性為91%，與甜椒的一致性為86%，與毛果楊、大豆、黃瓜等作物為60%以下，這說明LeRma1基因在這些植物中的一致性較低。

圖3 LeRma1 cDNA 的核苷酸及編碼氨基酸序列

圖4 番茄LeRma1與其他物種Rma1H1氨基酸序列保守區(qū)域的多重比對

2.3 番茄LeRma1的進(jìn)化樹分析

選取在氨基酸序列比對中相似度較高的9種植物，分析番茄LeRma1與其他物種中相關(guān)蛋白的進(jìn)化關(guān)系，用MEGA 4繪制進(jìn)化樹。結(jié)果(圖5)顯示，番茄的LeRma1與馬鈴薯和甜椒同屬1個(gè)分支，且與馬鈴薯進(jìn)化最近，其次是甜椒。葡萄和毛果楊的Rma1屬于同1個(gè)分支；野草莓和蘋果的Rma1屬于同1個(gè)分支；大豆、黃瓜和甜瓜的Rma1屬于同1個(gè)分支，其中黃瓜和甜瓜的進(jìn)化關(guān)系較近。

2.4LeRma1基因在番茄不同器官中的表達(dá)

采用半定量PCR方法，檢測番茄LeRma1基因在不同器官(根、莖、葉、花、果實(shí))的表達(dá)情況。如圖6所示，番茄LeRma1基因在根、莖、葉、花、果實(shí)中均有表達(dá)，且表達(dá)差異不明顯。

2.5 干旱脅迫下LeRma1及其他抗旱相關(guān)基因的表達(dá)分析

采用半定量RT-PCR方法，檢測干旱脅迫下，LeRma1基因和其他抗旱相關(guān)基因在番茄葉片和根部中的表達(dá)水平(圖7)。結(jié)果顯示，干旱脅迫下，LeRma1基因在番茄葉片和根部均有表達(dá)。隨著干旱脅迫進(jìn)行，番茄葉片中LeRma1的表達(dá)量呈先上升后下降又上升又下降的趨勢。在干旱處理1和3 d時(shí)，表達(dá)量有所增強(qiáng)，之后表達(dá)量下降，而在干旱10 d時(shí)，表達(dá)量又增加并達(dá)到最大，復(fù)水后表達(dá)減弱。番茄根部中LeRma1基因雖在干旱1 d時(shí)表達(dá)量有所下降，但在整個(gè)干旱過程中，其表達(dá)量變化并不明顯。

干旱脅迫下，抗旱相關(guān)基因LEA在番茄葉片和根部均有表達(dá)，在葉片中，其表達(dá)量呈上升趨勢，而在根部的表達(dá)量變化不明顯；抗旱相關(guān)基因DREB2A、ABI3在番茄葉片中均有表達(dá)，與對照相比，表達(dá)量均增加，說明該基因在葉片中增強(qiáng)表達(dá)，且在整個(gè)干旱過程中，表達(dá)量的變化不明顯；而在根部中，這2個(gè)基因基本沒有被檢測出來(圖7)。

圖5 部分物種的Rma1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 番茄LeRma1基因在不同器官的表達(dá)

2.6 干旱脅迫下LeRma1基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析

采用熒光定量PCR方法，檢測番茄LeRma1基因在干旱脅迫條件下的表達(dá)水平。結(jié)果(圖8)顯示，干旱脅迫下該基因在番茄葉片和根部均有表達(dá)。隨著干旱脅迫進(jìn)行，番茄葉片中LeRma1的表達(dá)量呈先上升后下降再升高的趨勢，且與對照相比表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢。在干旱處理3 d時(shí)有一次應(yīng)激反應(yīng)的上升，之后表達(dá)量下降；在干旱處理10 d時(shí)表達(dá)量又升高并達(dá)到最大，約為對照的9倍。LeRma1在復(fù)水后1 d其在葉片中的表達(dá)量下降。干旱脅迫下，基因表達(dá)量在根部的變化趨勢與葉片相反，呈現(xiàn)總體下降的趨勢。在干旱處理6 d時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最低，約為對照的0.5倍；與葉片相似，該基因在根部復(fù)水后1 d其表達(dá)又呈下降趨勢(圖8)。

圖8 番茄LeRma1基因干旱脅迫下在葉片和根部的表達(dá)

圖7 干旱脅迫下番茄LeRma1基因和干旱相關(guān)基因在葉片(A)和根部(B)的表達(dá)

2.7 干旱脅迫對番茄植株生理指標(biāo)影響

在干旱脅迫處理下，對其五葉期番茄植株的葉片和根部的生理指標(biāo)進(jìn)行了測定。結(jié)果(圖9)顯示，在干旱及復(fù)水處理過程中，MDA含量呈先升高后降低的趨勢。干旱脅迫導(dǎo)致葉片MDA含量明顯增加。其中，干旱處理10 d時(shí)，MDA含量增加最多，高出對照2倍之多，膜脂過氧化程度加重；而在復(fù)水后1 d時(shí)，MDA含量得到了降低，但仍高于對照，說明復(fù)水處理部分緩解了干旱脅迫導(dǎo)致的膜脂過氧化。根部MDA含量變化趨勢與葉片相似，均呈先升高后下降趨勢。

POD、CAT、SOD是植物體內(nèi)清除活性氧對細(xì)胞膜系統(tǒng)傷害的重要保護(hù)酶。從圖9可知，在干旱及復(fù)水過程中，番茄葉片SOD和CAT活性均呈先上升后下降再上升趨勢。干旱處理3 d，二者活性均明顯上升，而后逐漸下降；復(fù)水后活性得以上升。兩者根部變化趨勢同葉片相似。雖然根部CAT活性在干旱處理3 d時(shí)略低于對照，但二者之間差異并不顯著。番茄葉片POD活性在干旱脅迫及復(fù)水過程中也呈先上升后下降再上升趨勢。在干旱處理6 d時(shí)，POD活性達(dá)到最大隨后下降，復(fù)水后活性顯著上升。根部POD的活性在干旱脅迫與復(fù)水過程中整體高于葉片，呈先下降后上升再下降趨勢。盡管在干旱處理3 d時(shí)，POD活性略有下降，但與0 d相比，二者差異也均并不顯著。而在復(fù)水后，與葉片不同，根部POD活性顯著下降。

以上結(jié)果表明，干旱脅迫引起膜脂過氧化程度加劇，使番茄植株體內(nèi)MDA含量升高，植物為維持正常生長，POD、CAT、SOD保護(hù)酶系統(tǒng)均發(fā)揮作用。干旱脅迫后復(fù)水，清除活性氧保護(hù)酶SOD、POD和CAT的活性提高，MDA得到清除，膜系統(tǒng)的損傷得到恢復(fù)，透性降低，恢復(fù)原有正常的生理代謝機(jī)能。

2.8 在不同逆境脅迫下LeRma1基因的表達(dá)分析

利用半定量RT-PCR方法，檢測番茄中LeRma1基因在鹽、堿、高溫、低溫逆境脅迫的響應(yīng)表達(dá)情況。結(jié)果(圖10)顯示，鹽脅迫下，番茄LeRma1基因在葉片的表達(dá)有增強(qiáng)的趨勢，在3和6 h處有明顯增強(qiáng)，根部變化的趨勢與葉片相似，也在3 h處增強(qiáng)(圖10，A)；堿脅迫下，LeRma1基因在葉片的表達(dá)也是從3 h起呈增強(qiáng)趨勢(圖10，B)；高溫脅迫下，LeRma1基因在葉片的表達(dá)量在3和6 h處均增加，在根部3 h處表達(dá)略有增強(qiáng)(圖10，C)；低溫脅迫下，LeRma1基因在葉片的表達(dá)量從3 h開始持續(xù)增加，24 h時(shí)達(dá)到最大，根部在6和24 h時(shí)表達(dá)量增多，但不明顯(圖10，D)。

圖9 番茄植株在干旱脅迫下MDA含量與抗氧化酶活性變化

圖10 不同逆境脅迫下番茄LeRma1基因在葉片和根部的表達(dá)

以上結(jié)果表明，在鹽、堿、高溫、低溫脅迫下，LeRma1基因在番茄葉片和根部的表達(dá)幾乎都有增強(qiáng)的趨勢，且在上述脅迫下，該基因在葉片中均是脅迫3 h后誘導(dǎo)起始增強(qiáng)表達(dá)。

3 討 論

自從Rma1H1被作為干旱誘導(dǎo)基因被最初鑒定出來[20]，就使人們猜想，它在其他物種是否也具有抗非生物脅迫功能，進(jìn)而陸續(xù)對它進(jìn)行研究[14,16-17]。然而雖然在部分植物中LeRma1基因已被克隆，但在栽培經(jīng)濟(jì)作物番茄中尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)中采用RT-PCR的方法，獲得番茄LeRma1基因cDNA全長序列。對番茄LeRma1蛋白進(jìn)行跨膜分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有跨膜螺旋。并且在37～86氨基酸殘基處有1個(gè)RING-type鋅指蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)。這與Lee等[14]在辣椒中的LeRma1序列分析相類似，在其C末端具有跨膜結(jié)構(gòu)域，在N末端附近具有RING結(jié)構(gòu)域，氨基酸殘基具Zn2+結(jié)構(gòu)。在其他E3泛素連接酶同樣具有該Zn2+結(jié)構(gòu)[21-22]。番茄LeRma1與其他9種植物進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)番茄LeRma1氨基酸序列與馬鈴薯的一致性最高為91%，與毛果楊、大豆、黃瓜等作物一致性為60%以下，說明LeRma1基因在這些植物中的一致性較低。這同樣與Lee等[14]在辣椒中的LeRma1同源性分析結(jié)果相似，其選擇與RmaH1高度同源的Rma1、Rma2、Rma3進(jìn)行相互比對，發(fā)現(xiàn)在楊樹、擬南芥、水稻等植物的一致性均在50%以下，一致性同樣較低。

基因表達(dá)模式能夠反映基因特定的生物學(xué)功能。半定量分析表明，LeRma1在番茄根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，說明此基因編碼的蛋白在番茄各器官中普遍存在。而該基因編碼的蛋白即是E3泛素連接酶，前人研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)多種E3泛素連接酶在各器官中大都均有表達(dá)。Catala R等[23]發(fā)現(xiàn)一個(gè)SUMO E3泛素連接酶SIZ1，其在擬南芥中各組織均有表達(dá)。ZmRFP1是玉米中1個(gè)編碼RING-H2 E3泛素連接酶的基因[24]，該基因與擬南芥SDIR1同源[25]。ZmRFP1在各組織，包括葉、莖、穗和幼穗均有表達(dá)。擬南芥E3泛素蛋白酶AtSAP5[26]在根、莖、葉、花中均有表達(dá)。煙草RING-H2型基因RHF1編碼1個(gè)E3連接酶NtRHF1在根、莖、葉、花、成熟的果實(shí)不同器官中也均有表達(dá)[27]。

干旱脅迫下，半定量分析表明LeRma1基因在番茄葉片和根部均有表達(dá)。隨著干旱脅迫進(jìn)行，番茄葉片中LeRma1的表達(dá)量呈先上升后下降又上升又下降的趨勢。根部中LeRma1基因在整個(gè)干旱過程中表達(dá)量變化并不明顯?？购迪嚓P(guān)基因LEA、DREB2A、ABI3在葉片中表達(dá)量呈上升趨勢。進(jìn)而對LeRma1基因進(jìn)一步實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明：在干旱脅迫處理下，LeRma1基因在番茄葉片的表達(dá)量在脅迫初期呈現(xiàn)一次明顯的上升，略有下降后又上升，表達(dá)量總體上與對照相比呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。這與玉米中鑒定出的一個(gè)與水稻OsGW2同源的RING型E3泛素連接酶ZmGW2相似，在玉米苗期不同脅迫處理下，ZmGW2基因在根和葉中均被誘導(dǎo)表達(dá)，在干旱脅迫條件下，該基因前期表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，而后表達(dá)量逐漸下降[28]。LeRma1在根中表達(dá)量雖有變化，但相對于葉片還是穩(wěn)定的，且表達(dá)水平整體低于葉片。表明LeRma1基因是一個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)的基因且在葉片中優(yōu)勢表達(dá)。干旱脅迫誘導(dǎo)時(shí)葉、根中基因表達(dá)水平的不同說明該基因?qū)χ参锬褪芨珊得{迫所起的作用存在一定的組織差異性。這與Lee等[14]結(jié)果相似，其試驗(yàn)結(jié)果表明，葉組織是Rma1H1誘導(dǎo)辣椒響應(yīng)干旱脅迫的主要部位。

以上通過熒光定量PCR技術(shù)，證明了干旱脅迫處理對LeRma1基因表達(dá)有一定誘導(dǎo)作用。因此，可初步認(rèn)定LeRma1是一個(gè)受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的基因且在葉片中優(yōu)勢表達(dá)；進(jìn)一步表明該基因可能參與番茄的干旱應(yīng)答及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。而Lee等[14]對辣椒中的同源基因CaRma1轉(zhuǎn)入擬南芥的研究，發(fā)現(xiàn)CaRma1可以參與干旱脅迫誘導(dǎo)，其作用機(jī)制是可能通過抑制水通道蛋白PIP2;1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，并伴隨蛋白酶體對其的降解來減少PIP2;1在轉(zhuǎn)基因植物原生質(zhì)體中的水平，從而來響應(yīng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的脅迫。因此，推測番茄LeRma1基因是否也是通過該機(jī)制來實(shí)現(xiàn)干旱脅迫響應(yīng)的，還需進(jìn)一步研究。

與基因表達(dá)檢測的同時(shí)，本試驗(yàn)還對干旱處理番茄植株生理方面進(jìn)行檢驗(yàn)，MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一。干旱脅迫下，植物膜脂過氧化物MDA大量積累，而MDA含量的上升與膜透性的增加呈顯著的正相關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷，其積累是活性氧毒害作用的表現(xiàn)[29-30]。MDA能與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)、酶等結(jié)合，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，使之失活，從而破壞生物膜的結(jié)構(gòu)與功能[31]。因此，MDA被廣泛用作衡量膜脂過氧化損傷的指標(biāo)，可用MDA含量表示細(xì)胞遭受氧化損傷的程度。其含量高低反映了細(xì)胞膜脂過氧化作用的強(qiáng)弱，MDA含量增加，表明膜脂過氧化程度加劇。干旱脅迫使質(zhì)膜受損同時(shí)，可以使植物體內(nèi)活性氧(ROS)大量積累，ROS的產(chǎn)生對細(xì)胞具有一定的損傷作用。植物體內(nèi)存在清除活性氧的抗氧化酶系統(tǒng)(POD、SOD、CAT)。在正常生長條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，從而使植物體內(nèi)活性氧維持在較低的濃度范圍內(nèi)。干旱等逆境脅迫破壞了這種平衡[32-33]，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞使植物受損。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干旱脅迫下，質(zhì)膜系統(tǒng)在一定程度上受損，體內(nèi)MDA含量呈升高趨勢。番茄植株為維持正常生長，保護(hù)酶系統(tǒng)相應(yīng)發(fā)揮作用。該結(jié)果與何乘坤等[34]和孫三杰等[35]報(bào)道相似。干旱脅迫下，引起膜脂過氧化程度加劇，使番茄植株體內(nèi)MDA含量升高，POD、CAT、SOD保護(hù)酶系統(tǒng)活性上升，干旱處理后期酶活下降；干旱脅迫后復(fù)水，清除活性氧保護(hù)酶SOD、POD和CAT的活性重新提高，MDA得到清除，膜系統(tǒng)的損傷得到恢復(fù)，透性降低，恢復(fù)正常的生理代謝機(jī)能[34]。

此外，植物體內(nèi)多數(shù)E3泛素連接酶除具抗旱性外，還具有其他抗非生物脅迫的功能，比如，耐鹽堿、高低溫、外源激素ABA、乙烯等[14,17,22,26,28,36-37]。推測LeRma1基因也可能在植物抵抗以上非生物脅迫中發(fā)揮作用。本試驗(yàn)在對番茄LeRma1進(jìn)行干旱相關(guān)研究的同時(shí)，也對它在其他非生物脅迫中的作用進(jìn)行了初步研究。對五葉期番茄進(jìn)行鹽、堿、高溫、低溫脅迫處理，并用半定量RT-PCR方法檢測了LeRma1基因在以上非生物脅迫下的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，在上述脅迫下，LeRma1基因在番茄葉片和根部的表達(dá)幾乎都有增強(qiáng)的趨勢，且在葉片中是脅迫3 h后誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)，推測LeRma1基因可能在番茄抵抗以上非生物脅迫中發(fā)揮作用。其結(jié)果也與Lee等[14]相似，在鹽和低溫處理下，Rma1H1上調(diào)表達(dá)。因此，推測LeRma1基因可能作為上調(diào)基因在以上非生物脅迫中發(fā)揮作用，且該基因是否具有上述功能還需進(jìn)一步的研究。

本研究通過克隆番茄泛素E3連接酶LeRma1基因并對其表達(dá)進(jìn)行研究表明，該基因在番茄成株不同器官中均有表達(dá)，且差異不顯著。在干旱脅迫下，LeRma1基因在葉片中增強(qiáng)表達(dá)，而在根中表達(dá)相對穩(wěn)定，葉片中的表達(dá)水平整體高于根，可見該基因可能參與番茄的干旱應(yīng)答及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，且在不同器官所起的調(diào)節(jié)作用有一定的差異，其機(jī)理需進(jìn)一步研究。此外，研究結(jié)果表明該基因在番茄抵抗其他非生物脅迫中也可能發(fā)揮一定作用，其功能還需通過轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果為理解番茄的抗旱分子機(jī)理提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，為番茄抗旱及其他抗非生物脅迫遺傳改良提供了理論依據(jù)和候選基因資源。

致謝：本研究在植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression ofLeRma1 fromLycopersiconesculentumMill.

CHEN Mo1,2，JIN Xiaoxia1*，YU Lijie1，ZHU Hong1，DING Guohua1，F(xiàn)U Wenshang1，F(xiàn)U Chang1

(1 Life Science and Technology,Harbin Normal University,Key Laboratory of Plant Biology of Heilongjiang Province,Harbin 150025,China;2 Mishan No.1 Middle School,Mishan,Heilongjiang 158300,China)

The experiment cloned an E3 ubiquitin ligase geneLeRma1(GenBank accession No XM_004243764.1)by RT-PCR method with tomato ‘Hadafen 801’ used as experimental materials.To provide a theoretical basis for the cultivation and improved varieties of tomato,we analyzed the gene sequence,while studied the expression and physiological characteristics ofLeRma1 gene in different parts of the tomato plants under abiotic stress(drought,salt,alkali,high temperature,low temperature).The results showed that:(1)LeRma1 gene sequence analysis showed that the length ofLeRma1 gene was 729 bp,which encoded 242 amino acids.It was predicted that the molecular mass of its protein was 27.05 kD,and pI was 7.97.Homology analysis showed that the deduced amino acid sequence exhibited high homology with Solanum tuberosum(91% similarity).(2)RT-PCR results indicating that the gene were expressed in roots,stems,leaves,flowers and fruits of tomato,and the changes in expression levels were not significantly different.(3)Expression ofLeRma1 had the advantage in leaves,and the changes in expression levels were not significantly different in roots under the whole drought stress.The other drought-related genesDREB2A,LEA,ABI3 are all expression in leaves,and they were enhanced expression compared with the control,whileDREB2A,ABI3 have not detected in roots under the whole drought stress.(4)Major membrane lipid peroxidation product of MDA content was increased significantly,and plasma membrane systems were severely damaged,the protective enzyme activity increased significantly,and activity in roots was significantly higher than that in leaves.(5)LeRma1 gene was enhanced expression in roots and leaves of tomato,and the gene in the leaves all starting enhanced expression after stress 3 h under abiotic stress(salt,alkali,high temperature,low temperature).The results showed thatLeRma1 was the gene of enhancement expression by drought-induced and it had the advantage in leaves.It showed that there were some differences that the function of theLeRma1 genes in different tissues(organizational differences)under drought stress,andLeRma1 genes may be participate response of drought stress tolerance and the signal transduction process,it also might play an important role in the tomato under the other abiotic stresses.

tomato;LeRma1;clone;expression

1000-4025(2015)09-1735-11

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.09.1735

2015-05-07；修改稿收到日期：2015-08-20

黑龍江省教育廳面上項(xiàng)目(12531204，12531178)；植物生物學(xué)黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(ZK201205)；哈爾濱師范大學(xué)青年學(xué)術(shù)骨干資助計(jì)劃(KGB201218，09KXQ-01)；黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃；哈爾濱師范大學(xué)碩士研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(HSDSSCX2014-32) 作者簡介：陳 默(1989-)，女，在讀碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:chenmo1989smile@163.com

Q785；Q786

A

*通信作者：金曉霞，博士，講師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:xiaoxia6195@126.com