安維忠，劉雅莉，劉紅利，陳凱利

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵 712100)

葡萄風(fēng)信子MaANS基因及啟動(dòng)子的克隆與分析

安維忠，劉雅莉*，劉紅利，陳凱利

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊陵 712100)

該研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，在葡萄風(fēng)信子(Muscariarmeniacum) ‘亞美尼亞’中克隆到花青素合酶(ANS)基因的cDNA與DNA序列，該基因命名為MaANS。采用熒光實(shí)時(shí)定量分析MaANS時(shí)空表達(dá)模型，同時(shí)利用染色體步移法克隆到MaANS上游1 044 bp的一段序列。信息學(xué)分析表明：MaANS開放閱讀框?yàn)? 065 bp，編碼355個(gè)氨基酸；DNA與cDNA的一致性為89.62%，DNA序列在ATG下游515～594 bp之間插入1個(gè)79 bp內(nèi)含子；啟動(dòng)子序列在-70 bp位置有1個(gè)TATA-box，有多個(gè)光響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點(diǎn)等。熒光實(shí)時(shí)定量分析表明，MaANS基因在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，并且在完全著色期表達(dá)量最高。該研究結(jié)果為深入研究MaANS基因功能、分析葡萄風(fēng)信子著色機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

葡萄風(fēng)信子；MaANS；啟動(dòng)子；熒光實(shí)時(shí)定量

黃酮類物質(zhì)是植物中普遍存在的次生代謝物質(zhì)，在植物生長繁殖中作用廣泛[1]?；ㄇ嗨刈鳛榫哂写硇缘狞S酮類物質(zhì)，可以使植物組織呈現(xiàn)紅到藍(lán)的色素沉淀，從而吸引授粉者[2]。此外，花青素有益于人類健康，已有研究表明，花青素有抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌的作用，可以預(yù)防心腦血管疾病、糖尿病，并且可以改善視力。植物中的花青素合成途徑分為早期和晚期。在花青素合成途徑的晚期，花青素合酶(ANS)、二氫黃酮醇還原酶(DFR)和黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)對(duì)花青素合成途徑的調(diào)控最終導(dǎo)致花青素的形成[3]。

花青素合酶是花青素合成途徑中的一種酶，催化無色花青素到有色花青素的轉(zhuǎn)變[4]?；ㄇ嗨睾厦笇儆?-酮戊二酸-雙加氧酶(2-ODDs)蛋白家族，這個(gè)家族的蛋白都以分子氧為共有基質(zhì)，并且都含有二價(jià)鐵、2-酮戊二酸或者抗壞血酸鹽[5-6]。ANS蛋白氨基酸序列存在典型的DIOX_N結(jié)構(gòu)域(具有2-酮戊二酸-加雙氧酶活性的N端區(qū)域)和2OG-FeII_Oxy超家族結(jié)構(gòu)域。已有研究表明，白色蛇莓的形成是由于ANS基因的低表達(dá)造成[7]。CHS、DFR、ANS基因表達(dá)活性的上調(diào)，使得桑樹的果實(shí)變?yōu)榧t色[8]。大麗花冠、芍藥花冠的顏色形成都需要ANS表達(dá)，這些物種中ANS基因的表達(dá)受阻都會(huì)形成白色或無色花冠，ANS在植物器官顏色形成中起著重要的作用[9-10]。

葡萄風(fēng)信子的花瓣形狀獨(dú)特、藍(lán)色純正，并且?guī)е幕ㄏ?，是自然界重要的觀賞性花卉，具有很重要的美觀、生態(tài)與科研價(jià)值[11]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)葡萄風(fēng)信子藍(lán)色品種及白色品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，構(gòu)建了葡萄風(fēng)信子藍(lán)白花色差異的分子機(jī)理模型圖[12]。葡萄風(fēng)信子類黃酮代謝途徑的關(guān)鍵酶DFR、FLS基因已經(jīng)被克隆得到[13-14]。本研究在藍(lán)色葡萄風(fēng)信子‘亞美尼亞’品種中克隆了ANS基因及其啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行了初步信息學(xué)分析，為深入研究ANS基因的生物學(xué)功能和單子葉藍(lán)色模式植物葡萄風(fēng)信子的著色機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究于2014年在西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。材料為進(jìn)口的葡萄風(fēng)信子(Muscariarmeniacum)‘亞美尼亞’種球，種植于大棚。2014年3月底開始取材，4月中旬取材完畢。分別采集：完全未著色的花蕾(S1)、開始著色的花蕾(S2)、完全著色未開放的花蕾(S3)、完全開放的花蕾(S4)、衰敗的花蕾(S5)、根、莖、葉，于液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 RNA與DNA提取 采用Omega試劑盒提取葡萄風(fēng)信子總RNA，DNA的提取參照CTAB法[15]，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA及DNA純度及濃度。

1.2.2ANS基因cDNA、DNA及其啟動(dòng)子克隆 使用Preme Script RT reagent kit試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)合成cDNA第一鏈。分析轉(zhuǎn)錄組中ANS序列，Blast數(shù)據(jù)庫中分析其序列特征，初步確定其為全長，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)正向引物S，反向引物A(表1)，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，克隆ANS基因cDNA序列。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s；30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，純化回收目的條帶后，與pMD-19T Vector(TaKaRa) 16 ℃連接4 h，將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化30 μL大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞Top10中，經(jīng)涂有IPTG和X-gal的Amp平板上篩選白斑陽性克隆，菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒后，挑取白色菌落于100 mg/L Amp液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h，保存菌液，使用通用引物M13由北京奧科鼎盛測(cè)序部測(cè)序。

DNA克隆以基因組DNA為模板，引物與cDNA克隆采用同一對(duì)特異性引物。啟動(dòng)子克隆采用染色體步移法，設(shè)計(jì)1組特異性引物SP1、SP2和SP3(表1)，克隆體系嚴(yán)格參照Genomic Walking Kit產(chǎn)品說明書。ANS的DNA及啟動(dòng)子克隆程序同上述cDNA克隆，分別送樣測(cè)序鑒定。

1.2.3ANS基因序列及其編碼蛋白生物信息學(xué)分析 NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blastp(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins)在線網(wǎng)頁完成同源序列的搜索，導(dǎo)出同源序列，利用DNAMAN軟件對(duì)同源序列作多重比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在線查找開放閱讀框；利用ExPASy工具包中的ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)程序分析氨基酸序列的組成成分、分子量、等電點(diǎn)及編碼蛋白的親/疏水性；Tmpred Server(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)在線網(wǎng)頁分析蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP.Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號(hào)肽；PSORT軟件(http://psort.hgc.jp/form.html)進(jìn)行編碼蛋白亞細(xì)胞定位分析；NetPhos.Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)網(wǎng)頁中預(yù)測(cè)；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)由Phyre(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre/)在線工具完成；啟動(dòng)子及內(nèi)含子的預(yù)測(cè)在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)頁中完成。

表1 克隆及實(shí)時(shí)定量引物Table 1 Primer sequences used in cloning and real-time quantitative PCR

1.2.4ANS基因表達(dá)模式分析 各取500 ng葡萄風(fēng)信子不同發(fā)育時(shí)期的花蕾、根、莖和葉的RNA，用Preme Script RT reagent kit反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在Primer 5.0軟件中設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量正反向引物RtS和RtA(表1)。在BIO-RADCyclerIQ熒光定量PCR儀上進(jìn)行MaANS基因的表達(dá)分析，方法參照TaKaRa公司的SYBR?PremixExTaqTMⅡ說明書，反應(yīng)程序和體系參照焦淑珍等[9]，內(nèi)參基因?yàn)槠咸扬L(fēng)信子Actin基因。

2 結(jié)果與分析

2.1MaANS基因全長cDNA克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的ANS序列，分析其具有完整的開放讀碼框并設(shè)計(jì)cDNA全長引物，正向引物S，反向引物A(表1)。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，擴(kuò)增得到1條1 096 bp條帶(圖1，A)，測(cè)序后拼接。所得序列與轉(zhuǎn)錄組序列相似性為96.23%。ORF Finder鑒定開放閱讀框?yàn)? 065 bp，編碼355個(gè)氨基酸。該基因命名為MaANS。核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列如圖2。

圖1 MaANS基因擴(kuò)增結(jié)果

圖2 MaANS基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3 MaANS啟動(dòng)子序列及關(guān)健元件

2.2MaANS基因DNA及啟動(dòng)子序列克隆與分析

DNA序列克隆所用引物與cDNA克隆所用引物相同(表1)，克隆到1條1 144 bp條帶(圖1，B)。測(cè)序分析DNA序列，在ATG下游515～594 bp之間插入了1個(gè)79 bp內(nèi)含子，DNA與cDNA的一致性為89.62%。在plantcare數(shù)據(jù)庫中分析內(nèi)含子序列，發(fā)現(xiàn)此內(nèi)含子序列中含有1個(gè)CAAT-box，1個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif，1個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS，1個(gè)胚乳表達(dá)元件Skn-1_motif。

根據(jù)DNA序列設(shè)計(jì)啟動(dòng)子克隆引物SP1、SP2和SP3(表1)，克隆到1條1 044 bp條帶(圖1，E)。Plantcare數(shù)據(jù)庫分析啟動(dòng)子序列(圖3)，顯示，MaANS啟動(dòng)子中含有轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵元件TATA-box，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域廣泛存在的CAAT-box，厭氧誘導(dǎo)元件ARE、GC-motif，光響應(yīng)元件Box-4、GT1-motif、Sp1、TCCC-motif，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif、TGACG-motif，MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、MRE，胚乳表達(dá)調(diào)控元件Skn-1 motif，水楊酸響應(yīng)元件TCA-element等。

圖4 MaANS與其他植物ANS氨基酸序列比較

2.3 MaANS蛋白進(jìn)化樹分析

NCBI Blastp數(shù)據(jù)庫中檢索葡萄風(fēng)信子MaANS，結(jié)果顯示，MaANS蛋白與東方美人荷蘭鳶尾(Irisxhollandica)、中國石蒜(Lycorischinensis)的相似性最高，分別為80%和78%。與其他物種的相似性在63%～75%之間。與其他物種進(jìn)行蛋白序列分析(圖4)，顯示，MaANS蛋白氨基酸序列存在典型的DIOX_N結(jié)構(gòu)域(具有2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenase 蛋白活性的N端區(qū)域)和2OG-FeII_Oxy超家族結(jié)構(gòu)域。其結(jié)構(gòu)域位置分別在MaANS氨基酸序列的53～149和220～310的位置。

基于MaANS及其他物種的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)結(jié)果顯示，葡萄風(fēng)信子MaANS蛋白最先與單子葉的早花中國石蒜、洋蔥、東方美人荷蘭鳶尾等聚為一類，最后與蘋果、碧桃等雙子葉植物聚為一類。

2.4 葡萄風(fēng)信子MaANS蛋白的生物信息學(xué)分析

利用ProtScale分析，MaANS蛋白親水區(qū)大于疏水區(qū)所以為親水性蛋白，其最大值為2.467，最小值為-2.744。ProtParam預(yù)測(cè)分析表明，MaANS理論分子量為39.88 kD，該蛋白的等電點(diǎn)為5.35，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.80，屬于不穩(wěn)定蛋白。PSORT在線預(yù)測(cè)MaANS蛋白定位于線粒體和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的可能性最大，其預(yù)測(cè)數(shù)值分別為0.474和0.450。利用在線工具TMpred對(duì)MaANS蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在182～199區(qū)存在一個(gè)跨膜區(qū)。運(yùn)用SignalP.Server預(yù)測(cè)表明，MaANS蛋白不具有信號(hào)肽，表明其不是分泌蛋白。磷酸化是蛋白質(zhì)最重要的翻譯后修飾之一，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用。用NetPhos預(yù)測(cè)MaANS磷酸化位點(diǎn)，MaANS蛋白有9個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)。

SOPM預(yù)測(cè)的MaANS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，MaANS基因編碼的355個(gè)氨基酸殘基中，α螺旋占43.82%，無規(guī)則卷曲占28.37%，延伸鏈占17.42%，β-轉(zhuǎn)角占10.39%。用Phyre預(yù)測(cè)MaANS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其折疊方式為雙鏈β螺旋折疊。

2.5MaANS基因時(shí)空表達(dá)模型分析

為了研究MaANS基因在不同組織以及花發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)情況，分別提取葡萄風(fēng)信子根、莖、葉以及花發(fā)育的5個(gè)不同時(shí)期花蕾(S1～S5)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以之為模板，通過熒光定量PCR方法檢測(cè)MaANS的表達(dá)模式。結(jié)果(圖6)表明，MaANS在花中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，在其他組織(根、莖和葉)中微量表達(dá)?；ńM織中，MaANS從未著色的花蕾已經(jīng)開始表達(dá)，到完全著色但未開放的花蕾中表達(dá)量最高，之后表達(dá)量開始降低。

圖5 MaANS蛋白與其他物種的ANS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 MaANS基因表達(dá)量分析

3 討 論

ANS是花青素合成途徑中的重要酶類，屬于2-酮戊二酸-雙加氧酶(2-ODDs) 蛋白家族，這個(gè)家族的蛋白都以分子氧為共有基質(zhì)，并且都含有二價(jià)鐵、2-酮戊二酸或者抗壞血酸鹽[5-6]。MaANS蛋白氨基酸序列存在典型的DIOX_N結(jié)構(gòu)域(具有2-酮戊二酸-加雙氧酶活性的N端區(qū)域)和2OG-FeII_Oxy超家族結(jié)構(gòu)域。擬南芥[16]、芥菜[17]、芍藥[10]、紫薯[18]等多種植物的ANS基因已經(jīng)被克隆得到。本實(shí)驗(yàn)首次從葡萄風(fēng)信子中克隆得到ANS基因，推測(cè)的ANS蛋白與其他植物的ANS蛋白高度一致，與荷蘭鳶尾、中國石蒜的ANS相似性最高，分別為80%和78%。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，葡萄風(fēng)信子MaANS蛋白最先與單子葉的中國石蒜、洋蔥、東方美人荷蘭鳶尾等聚為一類，最后與蘋果、碧桃等雙子葉植物聚為一類。表明，葡萄風(fēng)信子ANS蛋白與單子葉植物親緣關(guān)系更近。

MaANS在花中高表達(dá)，從未著色的花蕾開始表達(dá)，到完全著色但未開放的花蕾中表達(dá)量最高，之后表達(dá)量開始降低，根、莖、葉中幾乎不表達(dá)。表明在葡萄風(fēng)信子中，MaANS的表達(dá)具有花特異性。水母雪蓮中，紅色愈傷組織和紅色愈傷長大的幼苗中ANS基因表達(dá)強(qiáng)烈，而在黃色的愈傷組織中ANS基因表達(dá)微弱，根中不表達(dá)[19]。芍藥中ANS基因在花中的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根莖葉中的表達(dá)[14]。這與本研究中MaANS基因在花中的高表達(dá)相一致。Yan等[17]在芥菜中克隆到1 377 bp的ANS序列，開放閱讀框1 077-bp，并分析黒籽株系和黃籽株系之間ANS的表達(dá)量與原花青素積累的關(guān)系，表明，黃籽株系中原花青素的缺失是由于ANS基因表達(dá)的缺失造成。擬南芥中TT18基因編碼ANS蛋白，當(dāng)將TT18基因突變后擬南芥種皮中的原花青素減少，并且形成了與野生型擬南芥種皮顏色明顯不同的黃色種子[20]。以上研究表明，ANS基因的表達(dá)水平與植物組織器官的顏色形成密切相關(guān)。

啟動(dòng)子是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和啟始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因上游，它可以響應(yīng)光、溫度、水分等環(huán)境因素，能夠特定地調(diào)控基因的表達(dá)。本文克隆到MaANS基因上游1 044 bp的一段啟動(dòng)子，TATA-box在ATG上游-70 bp的位置，含有若干光響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點(diǎn)。類黃酮生物合成途徑基因的上游啟動(dòng)子順式作用元件的存在是必要的[21]，可以充分激活基因的轉(zhuǎn)錄[22-23]。Wei等[18]克隆了紫薯中的ANS啟動(dòng)子，TATA-box在ATG上游-80 bp的位置，并且有若干光響應(yīng)元件及MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這與本研究中MaANS啟動(dòng)子特征相似。同時(shí)Wei等[18]通過研究ANS啟動(dòng)子與IbMYB1轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，認(rèn)為IbMYB1在花青素合成途徑中起著重要的作用。表明，通過對(duì)啟動(dòng)子的研究可以確定調(diào)控功能基因的轉(zhuǎn)錄因子，從而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室后期將通過研究MaANS基因與轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系，確定葡萄風(fēng)信子中花青素合成途徑重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，為葡萄風(fēng)信子花色研究提供理論依據(jù)。同時(shí)也將為通過基因工程手段合成特定的黃酮類物質(zhì)提供重要的應(yīng)用價(jià)值[24]。

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(編輯:宋亞珍)

Isolation and Analysis ofMuscariarmeniacumMaANSGene and Its Promoter

AN Weizhong,LIU Yali*,LIU Hongli,CHEN Kaili

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas,Ministry of Agriculture Key Laboratory of Horticultural Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China)

In this study,we cloned cDNA and DNA sequences of anthocyanin synthase (ANS) gene,namedMaANS,based on transcriptome sequencing inMuscariarmeniacum.We did real-time fluorescence quantitative analysis aboutMaANS.While taking advantage of chromosome walking.We cloned a 1 044 bp upstream sequence ofMaANS.Bioinformatic analysis showed thatMaANScontains a 1 065 bp open reading frame,encoding 355 amino acids.The consistency of cloned DNA and cDNA is 89.62%,DNA sequence inserts a 79 bp intron from 515 bp to 594 bp on downstream of ATG.TATA-box is at -70 bp of the promoter which has a plurality of light-responsive elements and MYB binding sites.Real-time fluorescence quantitative analysis showedMaANSwas predominant expression in flower and the expression level at fully colored stage was the highest.In this study,gene cloning and expression analysis onMaANSare important to in-depth study the function ofMaANSgene and analyze the colored mechanism ofMuscariarmeniacum.

Muscariarmeniacum;MaANS;promoter;real-time quantitative

1000-4025(2015)09-1728-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.09.1728

2015-05-07；修改稿收到日期：2015-07-16

國家自然科學(xué)基金(31170652，31471905)

安維忠(1989-)，男，在讀碩士研究生，主要從事分子育種的研究。E-mail:1069211204@qq.com

*通信作者：劉雅莉，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事園林植物遺傳育種研究。E-mail:lyl6151@126.com

Q785；Q786

A