鄭 蕊，岳思君，王麗娟，錢貽崧，代金霞

(1 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2 南昌大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，南昌 330031)

枸杞LbMYB103基因克隆及轉(zhuǎn)化擬南芥的研究

鄭 蕊1，岳思君1，王麗娟1，錢貽崧2，代金霞1

(1 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2 南昌大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，南昌 330031)

以枸杞品種‘寧杞1號(hào)’花藥為材料，采用 RT-PCR技術(shù)，分離了R2R3類MYB基因LbMYB103包含完整開放閱讀框(ORF)的cDNA片段，堿基序列與已知基因HQ415755完全一致。運(yùn)用Gateway技術(shù)構(gòu)建LbMYB103基因植物過表達(dá)載體pMDC83-LbMYB103，利用基因槍法將融合有綠色熒光蛋白(GFP)的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，將LbMYB103基因定位在細(xì)胞核。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，LbMYB103基因在花藥中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，果實(shí)中表達(dá)量較低，在根、莖和葉中均未檢測(cè)到其轉(zhuǎn)錄本，推測(cè)LbMYB103基因可能在花藥發(fā)育過程中起重要作用。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pMDC83-LbMYB103轉(zhuǎn)入擬南芥(Col-0)，經(jīng)篩選獲得T1代抗性再生植株52棵，PCR鑒定有41棵陽性植株，收獲T1代種子，經(jīng)抗性篩選獲得T2代抗性植株29棵，PCR鑒定有23棵陽性植株。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，LbMYB103在擬南芥植株的基因組中正常表達(dá)。表型觀察發(fā)現(xiàn)T1和T2代擬南芥花藥發(fā)育異常，花發(fā)育遲緩，果莢短小無種子，進(jìn)一步表明LbMYB103可能與植物的育性有關(guān)。該結(jié)果為進(jìn)一步開展枸杞遺傳轉(zhuǎn)化，深入研究LbMYB103基因在枸杞花藥發(fā)育過程中可能發(fā)揮的調(diào)控功能奠定了基礎(chǔ)。

枸杞；LbMYB103；植物過量表達(dá)載體；擬南芥；遺傳轉(zhuǎn)化

植物的生殖器官為動(dòng)物和人類提供了食物的主要來源?；ㄋ幨侵参锏男坌陨称鞴?，是花粉發(fā)育的場(chǎng)所，花藥發(fā)育過程涉及到復(fù)雜而精細(xì)的生理過程和分子機(jī)制，對(duì)花藥及花粉發(fā)育分子機(jī)理的研究有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

MYB類轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，以含有保守的MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)楣餐卣?，MYB結(jié)構(gòu)域是一段約51～52個(gè)氨基酸的肽段，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列[1-2]。含單一MYB結(jié)構(gòu)域(R1/2)的MYB轉(zhuǎn)錄因子在維持染色體結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要作用。含2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域(R2R3)的MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)主要參與次生代謝的調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生。含3個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域(R1R2R3)的MYB蛋白可能在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中起作用[3]。其中，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)目最多的一類MYB蛋白，它們以N-端含有由2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的DNA結(jié)合功能域?yàn)楣餐卣鳎珼NA結(jié)合功能域除特異結(jié)合DNA外，有時(shí)其中的堿性氨基酸可兼作核定位序列。R2R3-MYB具有廣泛的調(diào)控功能，包括調(diào)控次生代謝、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、激素刺激、生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫應(yīng)答、分生組織形成及細(xì)胞周期控制等。

模式植物擬南芥MYB家族成員功能研究較多，國(guó)際上已經(jīng)報(bào)道了數(shù)個(gè)與擬南芥花藥發(fā)育有關(guān)的MYB家族基因。如AtMYB26與花藥內(nèi)層細(xì)胞的細(xì)胞壁發(fā)育相關(guān)，影響花藥的開裂[4]；AtMYB32基因異常表達(dá)導(dǎo)致苯基丙酸類物質(zhì)合成途徑的變化，從而影響花粉壁的形成[5]。AtMYB33和AtMYB65是同源基因，在這2個(gè)基因的雙突變體中，絨氈層過度肥大，導(dǎo)致了花粉在減數(shù)分裂前發(fā)育異常[6]。AtMYB103下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致花藥絨氈層細(xì)胞發(fā)育缺陷，小孢子降解，存活的花粉粒缺失細(xì)胞壁而產(chǎn)生雄性不育[7]。

目前，已有許多植物的R2R3類MYB基因被克隆并被證明與植物的花藥發(fā)育有關(guān)，枸杞LbMYB103基因也屬于R2R3類MYB蛋白家族成員，但關(guān)于其生物學(xué)功能和表達(dá)特性的研究還未見報(bào)道。本研究分析了該基因的表達(dá)特征，并構(gòu)建了其植物過量表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥驗(yàn)證其功能，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化枸杞，深入研究該基因在枸杞花藥發(fā)育過程中可能發(fā)揮的功能提供理論依據(jù)及前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

寧夏枸杞品種‘寧杞1 號(hào)’正常季節(jié)生長(zhǎng)于寧夏育新公司試驗(yàn)田，材料的采集參考徐青等[8]的方法，分別采取四分體形成前期、四分體早期及四分體后期的花蕾、花、根、莖、葉和果實(shí)，用RNA Plant Extraction Kit(北京TIANGEN公司)提取總RNA，M-MLV cDNA合成試劑盒(上海Invitrogen公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 采用 Primer5.0 軟件，在LbMYB103的cDNA編碼框兩側(cè)設(shè)計(jì)帶有attB接頭的基因特異性引物L(fēng)bMYB103-BF(5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTAATGGCTAGGATTCGATGT-3′，下劃線處為attB1接頭)和LbMYB103-BR(5′-TCTTCATACCATTGGATCAATGAGGGGGACCACTTTGTACAAG AAAGCTGGGT-3′，下劃線處為attB2接頭)，擴(kuò)增特異片段，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 植物過量表達(dá)載體PMDC83-LbMYB103的構(gòu)建及鑒定 通過PCR的方法從枸杞cDNA中分離出含有LbMYB103完整ORF(含終止密碼子和attB序列)的DNA片段。純化PCR產(chǎn)物后，利用Gateway?Technology with ClonaseTMII試劑盒(上海Invitrogen公司)進(jìn)行BP反應(yīng)和LR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(北京TIANGEN公司)，在LB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Kan和50 μg/mL HygB)上篩選陽性克隆，采用PCR鑒定和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒pMDC83-LbMYB103正確性。植物轉(zhuǎn)化載體pMDC83(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)喻德躍教授惠贈(zèng))含有增強(qiáng)型35S CaMV啟動(dòng)子，可提高目的基因在受體植物中的表達(dá)量。

1.2.3 洋蔥表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化和GFP檢測(cè) 制備感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌EHA105(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)喻德躍教授惠贈(zèng))，通過凍融法將重組質(zhì)粒pMDC83-LbMYB103-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，在YEB固體培養(yǎng)基(含50 μg/mL Rif和50 μg/mL Kan)平板上篩選陽性克隆，進(jìn)行PCR鑒定。制備菌液，通過基因槍發(fā)法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞。共培養(yǎng)2 d后，將洋蔥表皮置于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在細(xì)胞中的位置。用含有pMDC83-GFP空載質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，其GFP定位結(jié)果作為陰性對(duì)照。

1.2.4LbMYB103基因組織特異性表達(dá) 隨機(jī)選取20株枸杞取樣后混合，分別提取不同時(shí)期不同部位總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 。以cDNA為模板，以枸杞組成型表達(dá)actin基因(GenBank 登錄號(hào)為HQ415754.1)為內(nèi)部參照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。actin基因引物為L(zhǎng)bactin F(5′-GACCTTCAATGTTCCCGCTATG-3′)和Lbactin R(5′-GCCATCACCAGAGTCCAACAC-3′)，LbMYB103基因引物為qLbMYB103 F(5′-ACCATTGTCACACTTCACTCTGTTC-3′)和qLbMYB103 R(5′-TGTTCCAATGGTTCTTGACATCA-3′)。PCR反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及融解曲線，通過比較2-△△Ct的方法進(jìn)行基因表達(dá)水平的相對(duì)定量分析[9]。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.2.5LbMYB103基因轉(zhuǎn)化擬南芥 通過根癌農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)法將pMDC83-LbMYB103轉(zhuǎn)化擬南芥(Col-0)，用于轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選的抗生素為50 μg/mL HygB。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定及LbMYB103表達(dá)分析 采用沾花法侵染擬南芥(Col-0)，獲得T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。種子用0.1%升汞消毒后，在含有50 μg/mL HygB的MS1培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)。將野生型植株及篩選獲得的抗性植株移栽至裝有蛭石的小盆中，22 ℃長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)，收獲T1代種子。用相同的方法對(duì)T1代種子消毒、抗性篩選及獲得T2轉(zhuǎn)基因抗性植株。

分別取轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥葉片，采用CTAB法提取基因組DNA。利用目的基因特異性引物L(fēng)bMYB103-BF和LbMYB103-BR檢測(cè)LbMYB103基因編碼框是否插入擬南芥基因組DNA中。同時(shí)，根據(jù)植物轉(zhuǎn)化載體上的潮霉素抗性基因Hygr設(shè)計(jì)引物hygF(5′-ATGTTGGCGACCTCGTATTGG-3′)和hygR(5′-CGTTATGTTTATCGGCACTTT-3′)，進(jìn)行陽性植株的PCR鑒定，實(shí)驗(yàn)設(shè)野生型擬南芥DNA為陰性對(duì)照。

隨機(jī)選擇PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因植株，以花藥cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，分析轉(zhuǎn)基因擬南芥中LbMYB103的表達(dá)情況，方法同1.2.4。擬南芥內(nèi)參基因(AT4G34270)引物序列分別為5′-ATCTGCGAAAGGGTATCCAGTTGAC-3′和5′-TGGAGAGCTTGATTTGCGAAATACCG-3′。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察 將T1代及T2轉(zhuǎn)基因擬南芥(Col-0)及野生型種子消毒后播種于固體篩選培養(yǎng)基(MS1 + 50 μg/mL HygB)上。待野生型及抗性植株長(zhǎng)出4片真葉時(shí)，移栽于裝有蛭石的盆中，22 ℃長(zhǎng)日照周期條件下生長(zhǎng)。觀察并記錄轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育情況和表型性狀。

2 結(jié)果和分析

2.1LbMYB103基因植物過量表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

利用Gateway技術(shù)，通過BP反應(yīng)和LR反應(yīng)構(gòu)建植物表達(dá)載體pMDC83-LbMYB103， T-DNA在pMDC83-LbMYB103載體中的結(jié)構(gòu)如圖1，A所示，該載體具有2×35S CaMV強(qiáng)啟動(dòng)子，可使LbMYB103在轉(zhuǎn)基因植株中組成型表達(dá)。用EcoRV酶切重組質(zhì)粒確認(rèn)目的基因的插入，得到了預(yù)期的片段(圖1,B)，表明植物表達(dá)載體pMDC83-LbMYB103構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證正確性后轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(EHA105)中。

2.2 LbMYB103亞細(xì)胞定位

蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)LbMYB103的N端具有核定位信號(hào)肽，推測(cè)LbMYB103可能位于細(xì)胞核內(nèi)。為驗(yàn)證這一推測(cè)，利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)LbMYB103進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究。構(gòu)建的植物表達(dá)載體pMDC83-LbMYB103-GFP中，LbMYB103的C末端與GFP融合(圖1，A)。質(zhì)粒DNA經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，采用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞。35S CaMV組成型啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)基因在細(xì)胞中表達(dá)，可通過顯微鏡觀察報(bào)告基因的綠色熒光信號(hào)來確定LbMYB103在細(xì)胞中的分布。結(jié)果顯示：未與LbMYB103融合的35S:GFP(陰性對(duì)照)分布于整個(gè)細(xì)胞中(圖2，A)，而LbMYB103:GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中(圖2，B)，說明LbMYB103是具有細(xì)胞核定位功能的蛋白。

2.3LbMYB103基因表達(dá)分析

為了了解LbMYB103基因在枸杞不同組織器官及花藥四分體發(fā)育前后時(shí)期的表達(dá)模式，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析。結(jié)果表明，LbMYB103基因在枸杞花及花藥中特異表達(dá)，在四分體時(shí)期表達(dá)量較高，果實(shí)中表達(dá)量較低，在根、莖及葉中未檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本(圖3)，因此推測(cè)LbMYB103基因主要在花藥發(fā)育過程中發(fā)揮作用。

圖1 pMDC83-LbMYB103植物表達(dá)載體的構(gòu)建

圖2 LbMYB103的亞細(xì)胞定位

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定及表型觀察

通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的沾花法侵染獲得LbMYB103轉(zhuǎn)基因T0代擬南芥，T1和T2代HygB抗性植株的篩選方法見1.2.6。轉(zhuǎn)基因植株因?yàn)門-DNA的插入而獲得HygB抗性，可在篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而非轉(zhuǎn)基因植株則會(huì)出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，最終枯萎死亡。將轉(zhuǎn)基因擬南芥移栽至裝有蛭石的小盆中，22℃長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)。

2.4.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定及表達(dá)分析 隨機(jī)選擇具有潮霉素抗性的T1和T2代LbMYB103轉(zhuǎn)基因擬南芥，提取葉片DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，確定目的基因插入植株的基因組DNA中。使用的基因特異引物為L(zhǎng)bMYB103-BF和LbMYB103-BR。以野生型擬南芥DNA為模板的PCR作為陰性對(duì)照。陽性轉(zhuǎn)基因植株樣品中得到一條大小為975 bp的條帶，陰性對(duì)照中沒有條帶(圖4，A)。 同時(shí)，用潮霉素抗性基因(Hygr)的特異性引物進(jìn)行PCR，陽性轉(zhuǎn)基因植株中得到長(zhǎng)度為515 bp擴(kuò)增片段，陰性對(duì)照中沒有條帶(圖4，B)。

圖3 LbMYB103基因在枸杞不同組織器官的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為了分析LbMYB103基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，隨機(jī)選擇PCR鑒定為陽性的9株T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行Real time-PCR，同時(shí)以野生型植株作為對(duì)照。結(jié)果表明在35S CaMV啟動(dòng)子作用下，LbMYB103基因可以在轉(zhuǎn)基因擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)，但表達(dá)水平有所差異(圖5)。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型性狀分析 先后對(duì)pMDC83-LbMYB103轉(zhuǎn)基因擬南芥T1和T2代植株進(jìn)行表型性狀觀察發(fā)現(xiàn)，在41棵T1代植株中，有17棵植株生長(zhǎng)矮小，花藥及角果發(fā)育異常。23棵T2代植株有12棵發(fā)育異常，表現(xiàn)有不育現(xiàn)象。與野生型擬南芥(圖6，A、C、E)相比，T1和T2代植株中，轉(zhuǎn)基因植株無花藥或花藥癟小，花藥開裂后無花粉釋放(圖6，B)；花發(fā)育時(shí)間異常，同一植株上部已有長(zhǎng)角果，而植株下部花發(fā)育遲緩或停止發(fā)育(圖6，D)，果莢短小，無種子，呈現(xiàn)不育(圖6，F(xiàn))。這些表型性狀都是可穩(wěn)定遺傳的。

圖4 pMDC83-LbMYB103轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定

3 討 論

R2R3類MYB基因是MYB蛋白家族中最大的亞家族之一，在植物特定的生理過程中發(fā)揮著重要的作用。已經(jīng)研究證明的一些MYB蛋白，如AtMYB21、AtMYB24、AtMYB57、AtMYB62、AtMYB103、AtMYB116、AmMYB305、AmMYB340、GhMYB24 和PsMYB26等，N-端都含有由兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的DNA結(jié)合功能域，都具有保守的W-MDDIW基序[10]。本研究從枸杞‘寧杞1號(hào)’中分離出LbMYB103基因，蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白也具有R2R3類MYB蛋白的特征，在LbMYB103編碼蛋白的N端有一個(gè)核定位信號(hào)肽，推測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)[11]。構(gòu)建了LbMYB103基因植物表達(dá)載體，利用洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，證實(shí)了這一推測(cè)，說明LbMYB103是具有細(xì)胞核定位功能的蛋白。

圖5 LbMYB103基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

圖6 pMDC83-LbMYB103轉(zhuǎn)基因擬南芥(Col-0)的表型性狀

實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明，LbMYB103基因在枸杞的花和花藥中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，果實(shí)中也檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本，但表達(dá)量較低。其它R2R3類MYB基因也具有類似的表達(dá)特性，如擬南芥MYB21、MYB24和AtMYB103基因[7,12-14]，棉花GhMYB24基因[15]。AtMYB24主要在花中表達(dá)，在花藥發(fā)育過程中受調(diào)控。由此推測(cè)，LbMYB103可能在花藥的發(fā)育過程中有重要的作用。

在擬南芥中，AtMYB103基因的突變，引起花藥發(fā)育異常，絨氈層細(xì)胞發(fā)育有缺陷，小孢子降解，存活的花粉粒缺失細(xì)胞壁導(dǎo)致雄性不育。過量表達(dá)AtMYB24引起轉(zhuǎn)基因植株花異常，產(chǎn)生異常的花粉粒、花藥不能裂開散粉。棉花GhMYB24基因在擬南芥中的過量表達(dá)導(dǎo)致花畸形、雄蕊花絲短化、花藥不開裂、少有成熟的花粉粒形成。本研究將LbMYB103編碼框全長(zhǎng)與35S CaMV組成型啟動(dòng)子相連，轉(zhuǎn)化擬南芥(Col-0)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中檢測(cè)到LbMYB103的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，說明LbMYB103已在擬南芥中異源表達(dá)。與野生型相比，在41棵T1代和23棵T2代轉(zhuǎn)基因植株中，分別有17棵和12棵植株生長(zhǎng)矮小，出現(xiàn)了無花藥或花藥癟小，花藥開裂后無花粉釋放現(xiàn)象。其中還發(fā)現(xiàn)花發(fā)育時(shí)間異常，同一植株上部已有長(zhǎng)角果，而植株下部花發(fā)育遲緩或停止發(fā)育，部分角果短小，果莢內(nèi)無種子，呈現(xiàn)不結(jié)實(shí)現(xiàn)象。結(jié)合基因組織器官表達(dá)特征及表型，推測(cè)枸杞LbMYB103可能與花藥的發(fā)育與花粉的形成有關(guān)，在絨氈層發(fā)育及小孢子的成熟過程中可能發(fā)揮重要作用。但其中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，需借助枸杞轉(zhuǎn)化體系以及相應(yīng)枸杞突變體從不同方面對(duì)枸杞花藥和果實(shí)發(fā)育進(jìn)行深入的研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning ofLbMYB103 from Wolfberry and Transformation intoArabidopsisthaliana

ZHENG Rui1,YUE Sijun1,WANG Lijuan1,QIAN Yisong2,DAI Jinxia1

(1.College of Life Science,Ningxia University,WBRPU Lab of National Education Ministry,Yinchuan 750021,China；2.Institute of Translational Medicine,Nanchang University,Nanchang 330031 ,China)

Using RT-PCR technology,we cloned the R2R3 MYB geneLbMYB103 cDNA fragment,which contains a complete open reading frame(ORF),from wolfberry variety ‘Ningqi No.1’.The base sequence was entirely consistent with that of the known geneHQ415755.The plant over expression vector pMDC83-LbMYB103-GFP was constructed with Gateway Technology and confirmed by enzyme digestion and sequencing.We transformed pMDC83-LbMYB103 into onion epidermal cells using particle bombardment and found that LbMYB103 was located in the nucleus.We used the real-time quantitative PCR approach to analyze the expression pattern ofLbMYB103 in various organs,and the result showed that expression ofLbMYB103 was the highest in flower and anther,relatively lower in fruits,but undetectable in leaf,stem and root,indicating thatLbMYB103 may play some roles in wolfberry reproductive organ process,such as anther development.We transformed pMDC83-LbMYB103 intoArabidopsisthaliana(Col-0)usingAgrobacterium-mediated method.After plant selection and regeneration,a total of 52 and 29 regenerated T1and T2plants with resistance were obtained respectively.The PCR detection showed that a total of 41 T1plants and 23 T2plants containingLbMYB103 gene,and the real-time PCR analysis proved thatLbMYB103 gene in transgenicA.thalianacould conduct normal expression.The phenotypic observation showed abnormal anther and flower development,shorten pods without seed both in T1and T2transgenicA.thaliana,further indicatingLbMYB103 gene might be related to the plant fertility.The results lay a foundation for further study on theLbMYB103 gene,which may play a regulating role in the process of wolfberry anther development.

wolfberry(LyciumbarbarumL.);LbMYB103;plant over-expression vector;Arabidopsisthaliana;genetic transformation

1000-4025(2015)09-1722-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.09.1722

2015-05-10；修改稿收到日期：2015-07-12

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360361，31360025，31260065)；2012年寧夏高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目；寧夏自然科學(xué)基金(NZ13031)

鄭 蕊(1972-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物基因工程研究。E-mail:xlzheng@126.com

Q785;Q789

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