陳芳蘭，林玉玲，陳裕坤，馮 新，張梓浩，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學 園藝植物生物工程研究所/園藝學院，福州 350002)

三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因克隆及其低溫下SA處理后的表達分析

陳芳蘭，林玉玲，陳裕坤，馮 新，張梓浩，賴鐘雄*

(福建農(nóng)林大學 園藝植物生物工程研究所/園藝學院，福州 350002)

以三明野生蕉(Musaspp.AB group)為材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得β-1,3葡聚糖酶5個基因(Mugsp1.2～Mugsp5)的cDNA和DNA序列。序列和生物信息學分析表明Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5的ORF長度分別為1 020、1 047、999、1 023和960 bp，分別編碼339、348、332、340和319個氨基酸；Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4蛋白具有N端和C端(CTPP)信號肽結(jié)構(gòu)，推測為Ⅰ類β-1,3葡聚糖酶，而Mugsp3只含有N端信號肽，無CTPP結(jié)構(gòu)，Mugsp5則不具有信號肽結(jié)構(gòu)；構(gòu)建Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4瞬時表達載體并轉(zhuǎn)化洋蔥表皮的亞細胞定位觀察結(jié)果顯示，常溫下Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4主要在細胞膜、細胞質(zhì)上表達，而經(jīng)過8 ℃低溫處理后Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4均能夠轉(zhuǎn)移至細胞核表達；β-1,3葡聚糖酶基因在不同低溫處理下的實時熒光定量(qRT-PCR)檢測結(jié)果顯示，β-1,3葡聚糖酶基因均能響應(yīng)低溫脅迫，是低溫脅迫相關(guān)基因，但基因間表達水平存在差異；低溫下SA處理后的定量結(jié)果顯示，SA處理會推遲β-1,3葡聚糖酶基因的表達。

三明野生蕉；β-1,3葡聚糖酶；水楊酸；低溫脅迫；亞細胞定位；實時熒光定量PCR

香蕉是芭蕉科(Musaceac)芭蕉屬(Musa)植物，是重要的觀賞植物和糧食作物。栽培香蕉適于在熱帶亞熱帶地區(qū)種植，低溫寒害會造成香蕉嚴重的葉片果實損傷，在觀賞和生產(chǎn)應(yīng)用上受到嚴重限制[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，野生蕉具有較強耐寒性和抗病性，與栽培香蕉相比，能夠在溫度更低，環(huán)境更惡劣的條件下生長，因此充分開發(fā)利用野生蕉的優(yōu)良特性，對改良香蕉種質(zhì)資源具有重要意義[3-5]。

植物在受到非生物脅迫(機械傷害、高溫、低溫、鹽脅迫等)時，除了會產(chǎn)生生理生化上的應(yīng)激反應(yīng)抵抗環(huán)境脅迫外，還會形成一系列的信號傳導(dǎo)途徑，激活逆境相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)包括β-1,3葡聚糖酶在內(nèi)的一系列抗逆蛋白來提高植物抵御環(huán)境傷害的能力[6-9]。β-1,3葡聚糖酶所屬的PR-2蛋白是一類重要的病程相關(guān)蛋白[10]，在抵抗真菌侵染、病蟲害、環(huán)境脅迫等方面具有重要作用[11-13]。β-1,3葡聚糖酶根據(jù)其進化關(guān)系、蛋白質(zhì)定位、功能和理化性質(zhì)等特點，可分為4類：Ⅰ類蛋白含有一個與液泡定位相關(guān)的C-端信號肽延伸結(jié)構(gòu)(CTPP)，通常定位于液泡上，主要由堿性蛋白組成，能夠被病原體、乙烯、紫外線照射及傷害誘導(dǎo)等表達，但受細胞分裂素和生長素的抑制；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類由于不含有CTPP結(jié)構(gòu)通常定位在細胞間隙和細胞外，一般為酸性蛋白，酸性蛋白能夠受到病原體、細胞分裂素、水楊酸等誘導(dǎo)表達[13-17]。目前對β-1,3葡聚糖酶在植物抗寒作用方面的研究相對較少，張妙霞[4]對野生蕉抗寒機理展開了初步研究，并在28 ℃常溫和15 ℃下處理30 h后轉(zhuǎn)入4 ℃處理64 h的低溫條件下，克隆到三明野生蕉堿性β-1,3葡聚糖酶基因Mugsp和Mugsp1，進行相關(guān)的生物信息學和定量表達分析后，推測Mugsp和Mugsp1是抗寒相關(guān)基因。

水楊酸(SA)是普遍存在于高等植物體中的內(nèi)源激素，廣泛參與植物的生長發(fā)育，同時也是響應(yīng)植物環(huán)境傷害的重要信號因子，研究表明，外施SA能夠緩解病蟲害、高溫、低溫、重金屬脅迫、鹽脅迫等造成的植物傷害[18-19]。近年來的研究表明，在非生物脅迫方面，SA能通過NP1-independent途徑，促進抗氧化酶及保護酶相關(guān)基因如SOD、APX、GST、HSP、AOX、LEA等的表達來清除植物體內(nèi)的過氧化物；也能通過NP1-dependent途徑誘導(dǎo)PR相關(guān)基因如葡聚糖酶基因、幾丁質(zhì)酶基因等的表達，共同提高植物抗性，促進植物體抵御環(huán)境脅迫的能力[20]。在SA緩解植物低溫脅迫方面，目前人們集中于SA作用于NP1-independent途徑的研究，在香蕉幼苗、甘藍幼苗、茄子幼苗、西洋杜鵑、黃瓜幼苗、水稻幼苗等不同科屬植物上均有報道[21-28]。對NP1-dependent途徑，即SA在低溫下誘導(dǎo)病程相關(guān)基因表達的研究較少，Chang-Kui Ding[17]的研究表明，水楊酸及茉莉酸能夠誘導(dǎo)低溫處理番茄果實中PR2和PR3基因的表達。本試驗通過克隆獲得5條三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因，分別為編碼酸性β-1,3葡聚糖酶的Mugsp2、Mugsp3、Mugsp5以及編碼堿性β-1,3葡聚糖酶的Mugsp1.2、Mugsp4，之后進行了基因的堿基序列、氨基酸序列及生物信息學的分析；對Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4進行洋蔥表皮亞細胞定位觀察；分析不同低溫及SA處理后β-1,3葡聚糖酶基因的定量表達情況，探討β-1,3葡聚糖酶基因的低溫表達機制。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗所用三明野生蕉組培苗由福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所繼代保存。

1.2 方 法

1.2.1 β-1,3葡聚糖酶基因的克隆及序列分析 以13 ℃處理36 h的三明野生蕉組培苗葉片為材料，參照天澤RNA提取試劑盒說明書進行總RNA的提取，并根據(jù)Thermo公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書合成cDNA，作為基因克隆模板。采用CTAB法進行三明野生蕉組培苗葉片DNA的提取。將Mugsp和Mugsp1的cDNA序列作為目標序列在小果野蕉基因組數(shù)據(jù)庫(http://banana-genome.cirad.fr/home)中Blast，選取結(jié)果最靠前的5條β-1,3葡聚糖酶基因序列作為參考序列進行同源克隆，使用DNAMAN設(shè)計不同基因間包含有開放閱讀框(ORF)的引物，用于cDNA及DNA的克隆，其中Mugsp1.2的ORF擴增采用張妙霞設(shè)計的引物序列。3′端非編碼區(qū)克隆采用RACE巢式PCR技術(shù)，根據(jù)已經(jīng)獲得的cDNA序列，設(shè)計2條3′-RACE引物，以auap為下游引物進行擴增。PCR反應(yīng)體系及擴增程序參考賴恭梯[29]的方法做適當調(diào)整。引物序列、退火溫度和用途見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳、回收、TA克隆后，將陽性克隆子送至鉑尚公司測序。測序結(jié)果采用DNAMAN、MEGA和ProParam、SignalP 4.0、TMpred、PSORT、NCBI-ProteinTools、Motif在線分析軟件對其核苷酸和氨基酸序列進行分析。

1.2.2 亞細胞定位觀察 對所獲得的其中3個β-1,3葡聚糖酶基因(Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4)的ORF序列進行限制性內(nèi)切酶分析，在基因編碼區(qū)的起始密碼子和終止密碼子處分別設(shè)計帶酶切位點NcoⅠ和SpeⅠ的上下游引物見表1，PCR擴增獲得帶酶切位點的ORF片段。采用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SpeⅠ分別雙酶切pCAMBIAl302-GFP質(zhì)粒及Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4的PCR產(chǎn)物(酶切體系參照Thermo酶切說明書)后，經(jīng)T4DNA 連接酶連接，獲得35S-Mugsp1.2-GFP、35S-Mugsp2-GFP、35S-Mugsp4-GFP重組質(zhì)粒，并送鉑尚公司測序以驗證載體構(gòu)建正確。采用凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入LBA4404農(nóng)桿菌，使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染洋蔥表皮細胞[30]。將侵染的洋蔥表皮材料，一部分置于25 ℃培養(yǎng)2～3 d后使用共聚焦成像儀觀察基因的亞細胞定位，另一部分在25 ℃培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移到8 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h，使用1 μg/mL DAPI染色后再進行亞細胞定位的觀察。

表1 基因克隆、亞細胞定位以及熒光定量PCR引物序列Table 1 List of primers used in gene cloning,subcellular localization,QRT-PCR

注：下劃線為酶切位點，黑體部分為保護性堿基。

Note：The restriction enzyme cutting sites were pointed out by underlines and protective bases were appeared in bold.

1.2.3 實時熒光定量表達分析 將生長健壯且長勢相近的三明野生蕉組培苗，分別經(jīng)不同溫度(28 ℃、20 ℃、13 ℃、4 ℃、0 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-6 ℃)下處理36 h，8 ℃低溫下處理1、4、8、12和24 h，8 ℃低溫下噴施0.5 mmol/L SA處理1、4、8、12和24 h后，取葉片于液氮速凍，置于-80 ℃保存，用于RNA提取。每個處理重復(fù)3次。參照SYBR Ex-ScriptTM試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于熒光定量表達分析。分別在Mugsp、Mugsp1的跨內(nèi)含子區(qū)域，Mugsp1.2區(qū)別于Mugsp、Mugsp1的外顯子區(qū)域設(shè)計特異性引物，Mugsp2和Mugsp4在靠近終止密碼的區(qū)域設(shè)計上游引物，3′-UTR區(qū)域設(shè)計下游引物，在Mugsp3的ORF區(qū)域，Mugsp5的5′-UTR區(qū)域分別設(shè)計上下游引物，引物序列見表1。以18S為內(nèi)參基因[4]。反應(yīng)體系和擴增程序參考賴恭梯方法[29]做適當調(diào)整。使用熒光定量PCR儀LightCycler 480(Roche)進行擴增。將不同處理的cDNA樣本的混合物稀釋不同倍數(shù)作為模板制作標準曲線，獲得E值在1.9～2.1之間，并驗證引物特異性，得到單峰溶解曲線。擴增反應(yīng)結(jié)束后，數(shù)據(jù)處理按照Pfaffi法，采用Excel計算基因相對表達量。每試驗3次獨立重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因cDNA和DNA序列的獲得

表2顯示，以合成的經(jīng)13 ℃處理36 h的三明野生蕉組培苗葉片cDNA為模板，經(jīng) PCR擴增得到5個單一片段，長度分別為1 122、1 181、1 198、1 120和1 292 bp。測序結(jié)果分析顯示，這5條序列均帶有完整ORF區(qū)，分別為1 020、1 047、999、1 023和960 bp。Blastn和功能結(jié)構(gòu)域分析顯示，這5條片段與其他物種β-1,3葡聚糖酶基因序列高度一致，編碼蛋白均具有糖基水解酶第17保守特征結(jié)構(gòu)域[LIVM].[LIVMFYWA]{3}[STAG]E[STA]GWP[STN].[SAGQ][13]。說明它們?yōu)槿饕吧兜摩?1,3葡聚糖酶基因，分別命名為Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5。之后進行3′-UTR巢式擴增，獲得Mugsp1.2、Mugsp2 3′-UTR長度分別為81和134 bp。 最后以三明野生蕉葉片DNA為模板，克隆獲得Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4、Mugsp5 DNA序列，長度分別為1 207、1 198、1 211和1 292 bp(表2)。

2.2 三明野生蕉與小果野蕉β-1,3葡聚糖酶基因序列比對分析

以三明野生蕉為材料，克隆獲得的β-1,3葡聚糖酶基因序列。結(jié)果分析顯示，β-1,3葡聚糖酶基因間具有較高相似性，為80.52%(ORF)，Mugsp3和Mugsp5無內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，而Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4均包含1個內(nèi)含子，2個外顯子，內(nèi)含子剪接均符合GT-AG剪切規(guī)則(圖1)。

三明野生蕉與小果野蕉的β-1,3葡聚糖酶基因序列比對發(fā)現(xiàn)，Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5分別與小果野蕉β-1,3葡聚糖酶基因GSMUA_Achr10T01250_001、GSMUA_Achr8T22040_001 、GSMUA_Achr8T22450_001 、GSMUA_Achr3T08030_001和GSMUA_Achr8T22440_001具有高度相似性，但在基因內(nèi)含子剪接和翻譯位點上存在較大差異(圖1)。Mugsp1.2與GSMUA_Achr10T01250_001有著相同的內(nèi)含子剪切位點，編碼基本一致的氨基酸序列；Mugsp2和Mugsp4 與GSMUA_Achr8T22040_001和GSMUA_Achr3T08030_001不同的內(nèi)含子剪切位點，使得Mugsp2和Mugsp4形成更長的轉(zhuǎn)錄本，從而編碼更長的氨基酸序列；而翻譯起始位點的不同使得Mugsp3、Mugsp5比GSMUA_Achr8T22450_001、GSMUA_Achr8T22440_001編碼更短的氨基酸序列。這種基因結(jié)構(gòu)的差異，使得三明野生蕉與小果野蕉形成不同的β-1,3葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)錄本，從而導(dǎo)致翻譯的β-1,3葡聚糖酶在結(jié)構(gòu)和功能上存在差別。

表2 β-1,3葡聚糖酶基因cDNA及DNA序列信息Table 2 The information of β-1,3-glucanase cDNA and DNA sequences

圖1 三明野生蕉及小果野蕉β-1,3葡聚糖酶基因結(jié)構(gòu)示意圖

將Mugsp1.2與Mugsp(915 bp) 和Mugsp1(951 bp)[4]對比發(fā)現(xiàn)，Mugsp1.2 比Mugsp、Mugsp1多出104和69 bp堿基，其余部分基本匹配。觀察基因結(jié)構(gòu)(圖1)發(fā)現(xiàn)，Mugsp1.2比Mugsp和Mugsp1多出的片段正好與位于Mugsp-DNA、Mugsp1-DNA中與外顯子相接的內(nèi)含子片段相吻合，并且Mugsp1.2、Mugsp、Mugsp1中，只有Mugsp1.2符合GT-AG內(nèi)含子剪切規(guī)則。因此認為Mugsp1.2、Mugsp、Mugsp1是來自于同一基因的不同轉(zhuǎn)錄本，但是Mugsp1.2才是Mugsp1.2、Mugsp、Mugsp13個基因中的正常轉(zhuǎn)錄本，Mugsp、Mugsp1可能是外顯子缺失型的可變剪接體[31-33]。即Mugsp在剪切時將連接內(nèi)含子5′和3′端的51和53 bp外顯子一同切除，Mugsp1在剪切時則將連接內(nèi)含子3′端的69 bp外顯子切除。

2.3 三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶生物信息學分析

利用DNAMAN將克隆獲得的β-1,3葡聚糖酶基因序列翻譯成氨基酸序列，進行生物信息學分析， Mugsp1.2、Mugsp4屬于堿性β-1,3葡聚糖酶，Mugsp2、Mugsp3、Mugsp5屬于酸性β-1,3葡聚糖酶(表3)。5個β-1,3葡聚糖酶基因富含的氨基酸情況為(氨基酸含量大于8%)：Mugsp1.2富含Ala 11.2%、Ser 9.7%、Val 9.7%、Gly 8.3%和Leu 8.3%，Mugsp2富含Ala 10.6%、Ser 11.8%和Val 9.5%；Mugsp3富含Asn 8.4%、Leu 9.3%、Ser 11.1%和Val 10.8%，Mugsp4富含Ala 11.5%、Val 10.9%和Ser 8.8%的氨基酸，Mugsp5富含Ala 9.4%、Leu 8.5%和Ser 8.8%。分析氨基酸序列比對圖(圖2)，結(jié)果顯示Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4均編碼有21個氨基酸組成的N端前導(dǎo)信號肽序列，并且具有C端延伸信號肽序列(CTPP)結(jié)構(gòu)的N-糖基水解酶位點，推測Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4屬于Ⅰ類β-1,3葡聚糖酶，而Mugsp3只含有N端信號肽，無CTPP結(jié)構(gòu)，Mugsp5不具有信號肽結(jié)構(gòu)，因此Mugsp3和Mugsp5可能歸于后三類β-1,3葡聚糖酶[15,16,34]。將三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因與多個物種的β-1，3葡聚糖酶氨基酸序列進行進化樹分析(圖3)，結(jié)果可以分為2大分支體系，Ⅰ類Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4與擬南芥(Arabidopsisthaliana)β-1，3葡聚糖酶基因BG1(AT3G57270.1)、BG2(AT3G57260.1)、BG3(AT3G57240.1)、BETAG4(AT5G20330.1)、BG5(AT5G20340.1)處于同一分支體系，進化關(guān)系較近，其中堿性Mugsp1.2、Mugsp4與生姜(Zingiber)親緣關(guān)系最接近，酸性Mugsp2與豆科的田菁(Sesbaniarostrata)親緣關(guān)系最接近；Mugsp、Mugsp1、Mugsp3、Mugsp5則與海棠(Jatrophacurcas)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、無油樟(Amborellatrichopoda)獨立為另一分支體系。

表3 β-1,3葡聚糖酶基因翻譯的氨基酸序列特征Table 3 The amino acid sequence characteristics of β-1,3-glucanase genes

圖2 β-1,3葡聚糖酶基因間的氨基酸序列比對圖

2.4Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4的亞細胞定位分析

利用PSORT預(yù)測Mugsp2主要在細胞質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表達，而Mugsp1.2和Mugsp4在細胞外表達。試驗中根據(jù)GFP熒光蛋白信號在洋蔥表皮上的分布，觀察Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4常溫和低溫處理下亞細胞定位。常溫處理結(jié)果(圖4)顯示，Mugsp1.2-GFP、Mugsp2-GFP和Mugsp4-GFP蛋白主要分布在細胞膜、細胞質(zhì)上，GFP空載體蛋白在細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜、細胞間隙處均有分布；8 ℃低溫處理結(jié)果(圖5)顯示，經(jīng)核染料DAPI染色過的洋蔥表皮細胞核呈現(xiàn)藍色熒光信號， Mugsp1.2-GFP、Mugsp2-GFP和Mugsp4-GPF融合表達載體的綠色熒光信號除了分布在細胞膜和細胞質(zhì)外，還與DAPI染色的核熒光信號重疊，說明Mugsp1.2-GFP、Mugsp2-GFP和Mugsp4-GPF在低溫下均能夠轉(zhuǎn)移至細胞核表達。

圖3 三明野生蕉及其他物種β-1,3葡聚糖酶的系統(tǒng)進化樹分支上的數(shù)字代表1 000次Bootstrap重復(fù)驗證中該節(jié)點的可信度百分比值

2.5 低溫處理下β-1,3葡聚糖酶基因表達分析

利用實時熒光定量，檢測不同溫度處理下，三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因的表達水平。結(jié)果(圖6)顯示，隨著溫度降低，Mugsp、Mugsp1和Mugsp1.2呈現(xiàn)“先升高后降低”的表達趨勢，Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5呈現(xiàn)“先降低后升高再降低”的表達趨勢；Mugsp、Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp5在4 ℃時達到表達高峰，表達量分別為常溫的2.5、2.2、3.5和1.4倍左右，而Mugsp1、Mugsp3和Mugsp4在0 ℃表達量達到最高，分別為常溫的2.7、5和4.5倍左右。總體上，Mugsp、Mugsp2、Mugsp4和Mugsp5對溫度變化的響應(yīng)較為平緩，表達量較低，而Mugsp1、Mugsp1.2和Mugsp3對溫度變化響應(yīng)劇烈，表達量較高。說明β-1,3葡聚糖酶基因均能夠響應(yīng)低溫脅迫改變表達量，但是基因間的表達趨勢和表達水平存在差異。

2.6 低溫下SA處理后β-1,3葡聚糖酶基因表達分析

對三明野生蕉組培苗進行8 ℃低溫及8 ℃下噴施SA處理，處理時間為0～24 h。實時熒光定量結(jié)果(圖7)顯示，β-1,3葡聚糖酶基因能夠在8 ℃低溫處理1～4 h內(nèi)顯著提高表達量，其中Mugsp、Mugsp1和Mugsp1.2在低溫處理1 h時達到高峰，而Mugsp2、Mugsp4和Mugsp5在處理4 h時達到高峰。8 ℃低溫下噴施SA則推遲了β-1,3葡聚糖酶基因的表達，使得Mugsp、Mugsp1和Mugsp1.2在處理12 h時達到最高，且高于未噴施SA達到高峰時的表達量，而Mugsp2、Mugsp4和Mugsp5在SA處理12 h后開始升高，并且在處理24 h時已顯著超過未噴施SA所達到的表達高峰。說明β-1,3葡聚糖酶基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)呈現(xiàn)較為敏感的即時效應(yīng)，均能在短時間內(nèi)快速提高表達水平，并且在低溫下能夠被SA調(diào)控表達。

圖4 常溫下Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位

圖5 8℃低溫處理后Mugsp1.2、Mugsp2和Mugsp4在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位

圖6 β-1,3葡聚糖酶基因在不同溫度下處理36 h的相對表達

圖7 β-1,3葡聚糖酶基因不同處理下的相對表達量A、B、C分別為常溫28 ℃、8 ℃、8 ℃+SA處理0～24 h的β-1,3葡聚糖酶基因相對表達量

3 討 論

3.1 β-1,3葡聚糖酶基因的可變剪接可能參與低溫脅迫相關(guān)反應(yīng)

β-1,3葡聚糖酶基因是一類重要的逆境脅迫相關(guān)基因[35]。本試驗通過對三明野生蕉β-1,3葡聚糖酶基因進行不同處理的定量表達結(jié)果分析表明，β-1,3葡聚糖酶基因均能夠響應(yīng)低溫脅迫，是低溫脅迫相關(guān)基因，在抗寒中起到重要作用。β-1,3葡聚糖酶基因?qū)Φ蜏孛{迫的響應(yīng)可分為2種類型：Mugsp、Mugsp1，Mugsp1.2對低溫響應(yīng)更為敏感(8 ℃處理1 h即達到表達高峰)，隨著溫度的降低，能夠迅速啟動抗寒響應(yīng)機制，呈現(xiàn)直接“升高后降低”的表達趨勢；而Mugsp2、Mugsp3、Mugsp4和Mugsp5對低溫表現(xiàn)出一段時間的適應(yīng)過程(8 ℃處理4 h達到表達高峰)，隨著溫度的降低呈現(xiàn)“先降低后升高再降低”的表達趨勢?？傮w上β-1,3葡聚糖酶基因均能夠相繼在4 ℃和0 ℃處理下達到表達高峰，推測低溫脅迫下，β-1,3葡聚糖酶基因能夠分工協(xié)作，協(xié)同表達提高植物抵抗低溫傷害的能力。研究表明可變剪接現(xiàn)象在真核生物界普遍存在，環(huán)境脅迫能夠激發(fā)基因不同可變剪接體的表達，從而上調(diào)相關(guān)蛋白的表達水平，增強植物抵抗逆境的能力[36-38]。本試驗發(fā)現(xiàn)，不同低溫處理誘導(dǎo)了Mugsp、Mugsp1和Mugsp1.2三個剪接體的表達，剪接位點的差異使得Mugsp、Mugsp1、Mugsp1.2在植物體中的轉(zhuǎn)錄水平和對低溫的響應(yīng)水平上存在差異：總體上Mugsp1、Mugsp1.2的轉(zhuǎn)錄水平遠高于Mugsp，推測Mugsp與內(nèi)含子5端相接部分的可變外顯子片段缺失可能是造成Mugsp比Mugsp1、Mugsp1.2轉(zhuǎn)錄水平低的關(guān)鍵；低溫處理下Mugsp、Mugsp1.2在4 ℃表達量最高，而Mugsp1在0 ℃時才達到最高表達量，可能Mugsp、Mugsp1.2與Mugsp1具有差異的3端可變剪接片段對調(diào)控基因響應(yīng)低溫脅迫起到重要作用。

3.2 低溫誘導(dǎo)Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4的亞細胞定位改變從而提高抗寒性

本試驗利用共聚焦顯微鏡觀察到常溫下，Ⅰ類β-1,3葡聚糖酶基因Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4不僅定位于膜系統(tǒng)，還有少量定位在細胞質(zhì)中。研究表明，許多基因并不只存在一種蛋白定位，如NRIP1、NPR1等一些R基因的多種定位是其能夠執(zhí)行功能的關(guān)鍵[39,40]。推測β-1,3葡聚糖酶在細胞膜系統(tǒng)及細胞質(zhì)的分布使得β-1,3葡聚糖酶可能執(zhí)行蛋白轉(zhuǎn)運及信號傳遞等功能。此外許多基因能夠被代謝干擾、信號傳導(dǎo)、環(huán)境改變等刺激改變其亞細胞定位[39-42]。如擬南芥中，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的β-1,3葡聚糖酶AtBG2在SA處理下能夠分泌到質(zhì)外體中[43]。本試驗對Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4的亞細胞定位試驗進行了低溫處理，觀察低溫對Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4表達的影響，結(jié)果顯示8 ℃低溫處理下Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4均能夠轉(zhuǎn)移至細胞核表達，結(jié)合定量結(jié)果Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4從13 ℃到4 ℃處理之間的基因表達量急劇升高，推測Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4基因在低溫下大量表達，一部分翻譯成抗逆蛋白直接參與抗寒作用，另一部分則轉(zhuǎn)移至細胞核，作為其他低溫脅迫相關(guān)基因的信號傳導(dǎo)因子起調(diào)控作用。相關(guān)作用機理已有報道，如在擬南芥中，EDS1對抗病基因的誘導(dǎo)需要在定位于細胞核的RPS4基因的調(diào)控下才能起作用[44]。因此推測Mugsp1.2、Mugsp2、Mugsp4的抗寒途徑及作用方式并不是唯一的，而是與其他抗寒調(diào)節(jié)相關(guān)因子形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從而共同抵抗植物的低溫脅迫。

3.3 低溫下SA調(diào)控β-1,3葡聚糖酶基因表達的可能機制

Tomoya Niki等[45]認為SA是堿性β-1,3葡聚糖酶基因的抑制因子，是酸性β-1,3葡聚糖酶基因的激發(fā)因子，反之JA是堿性β-1,3葡聚糖酶基因的激發(fā)因子，是酸性β-1,3葡聚糖酶基因的抑制因子，植物受到機械傷害下，內(nèi)源SA不會變化，而JA能夠積累，因此機械傷害會促進堿性β-1,3葡聚糖酶基因的表達，但不會誘導(dǎo)酸性β-1,3葡聚糖酶基因表達。而Chang-Kui Ding[17]用低溫處理西紅柿果實0～28 d發(fā)現(xiàn)，SA和JA都能夠促進了堿性β-1,3葡聚糖酶基因的表達。因此SA和JA在受到機械傷害和低溫脅迫下對PR蛋白的誘導(dǎo)機制是不同的。本試驗定量結(jié)果表明，SA能夠通過NP1-dependent途徑推遲8 ℃低溫下堿性和酸性β-1,3葡聚糖酶基因的表達。前人研究表明低溫會使植物體內(nèi)的細胞膜結(jié)構(gòu)首先出現(xiàn)變化，膜脂相變導(dǎo)致細胞代謝失調(diào)是植物受到寒害的關(guān)鍵[46-48]。推測8 ℃低溫破壞了細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使定位于膜系統(tǒng)上的β-1,3葡聚糖酶基因能夠快速響應(yīng)低溫傷害大量表達，而低溫下SA處理在短時間內(nèi)保護了植物細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和完整性，從而減緩了細胞膜受到的低溫傷害[21,22,28]。因此低溫下SA處理延緩了細胞膜受到低溫傷害的時間，使得β-1,3葡聚糖酶基因因未能感受到膜變化而推遲表達。β-1,3葡聚糖酶基因的表達機制還有待更為深入的研究。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Expression Analysis under Cold and SA Treatments of β-1,3-glucanase Genes from the Wild Banana in Sanming City

CHEN Fanglan，LIN Yuling,CHEN Yukun，F(xiàn)ENG Xin，ZHANG Zihao，LAI Zhongxiong*

(Institute of Horticultural Biotechnology/College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

The cDNA and DNA sequences of β-1,3-glucanase genes (Mugsp1.2-Mugsp5) were cloned from the leaves of the wild banana(Musaspp.) in Sanming City using RT-PCR and RACE methods.Sequences and bioinformatics analysis showed that the ORF sequences ofMugsp1.2,Mugsp2,Mugsp3,Mugsp4 andMugsp5 were 1 020,1 047,999,1 023 and 960 bp,respectively,which encoded 339,348,332,340 and 319 amino acids,respectively.Mugsp1.2,Mugsp2 and Mugsp4 contained both N-terminal and C-terminal(CTPP) signal peptide,suggesting they belong to Ⅰclass of β-1,3-glucanase,while Mugsp3 contained N-terminal without CTPP signal peptide,and Mugsp5 contained neither N-terminal nor CTPP signal peptide.We constructed the expression vectors ofMugsp1.2,Mugsp2,Mugsp4 and expressed the genes in onion epidermal cells.The results of subcellular localization showed thatMugsp1.2,Mugsp2,Mugsp4 were expressed on plasma membranes and cytoplasm at room temperature,respectively,while allMugsp1.2,Mugsp2 andMugsp4 could transfer to cell nucleus under 8 ℃.The expressions of β-1,3-glucanase genes under diffierent tempertaures were dectected by qRT-PCR.The results revealed that all β-1,3-glucanase genes responded to cold stress,but their expression levels were differed from each other.SA treatment under low temperature would delayed the expression of β-1,3-glucanase genes.

Sanming wild banana;β-1,3-glucanase;salicylic acid;cold stress;subcellular localization;qRT-PCR

1000-4025(2015)09-1709-13

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.09.1709

2015-05-08；修改稿收到日期：2015-07-20

國家香蕉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金(CARS-32-11)；福建省農(nóng)業(yè)科技平臺(2008 N2001)

陳芳蘭(1991-)，女，在讀碩士研究生，主要從事花卉生物技術(shù)研究。E-mail:fl59xw@sina.com。

*通信作者：賴鐘雄，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究。E-mail:laizx01@163.com。

Q786;Q789

A