張莉英，張 檀，覃世榕

(寧波市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科,浙江寧波 315120)

重度子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞改變與發(fā)病孕周的關(guān)系*

張莉英，張 檀△，覃世榕

(寧波市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科,浙江寧波 315120)

目的 探討子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T淋巴細(xì)胞(Treg)的比例改變與發(fā)病孕周之間的關(guān)系。方法 2010年1月至2011年12月對(duì)寧波市婦女兒童醫(yī)院早發(fā)型重度子癇前期患者20例、晚發(fā)型重度子癇前期患者20例、28～34周的正常妊娠組20例及34周以后的正常妊娠20例，采用流式細(xì)胞儀檢測其外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg的比率，分析其與子癇前期發(fā)病及發(fā)病孕周之間的關(guān)系。結(jié)果 早發(fā)型和晚發(fā)型子癇前期患者婦女外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例分別為(2.80±0.54)%、(3.23±0.44)%，分別低于28～34、>34周正常妊娠組婦女外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例 (3.48±0.31)%、(3.58±0.41)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且早發(fā)型子癇前期患者婦女外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例低于晚發(fā)型子癇前期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。28～34、>34周正常妊娠組婦女外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 CD4+CD25+Foxp3+Treg的減少可能參與子癇前期的發(fā)病，下降程度可能與子癇前期發(fā)病孕周密切相關(guān)。

先兆子癇；流式細(xì)胞術(shù)；CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞

子癇前期嚴(yán)重威脅母嬰安全,尤其是早發(fā)型子癇前期，已成為妊娠婦女和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。盡管其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但研究顯示子癇前期患者存在母胎免疫耐受不良依據(jù)[1-3]。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是近年來新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體維持外周免疫耐受自然機(jī)制的決定因素，F(xiàn)oxp3是控制CD4+CD25+Treg發(fā)育及其功能效應(yīng)的關(guān)鍵基因。有研究認(rèn)為CD4+CD25+Treg可能是調(diào)控母胎界面局部免疫耐受形成的一個(gè)重要因素[4-6]。本研究分別對(duì)早發(fā)型子癇前期患者、晚發(fā)型子癇前期患者以及與他們?cè)兄芟鄬?duì)應(yīng)的正常妊娠婦女外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例進(jìn)行了分析研究，旨在探討Treg與重度子癇前期發(fā)病及發(fā)病孕周的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 早發(fā)型子癇前期組：選擇2010年1月至2012年12月寧波市婦女兒童醫(yī)院住院的34周或34周前診斷為重度子癇前期患者共20例作為研究對(duì)象，年齡22～34歲，中位數(shù)年齡28歲，孕周28～34周，中位數(shù)孕周32周。晚發(fā)型子癇前期組：選擇同期住院的34周后診斷為重度子癇前期患者共20例，年齡24～39歲，中位數(shù)年齡30歲，孕周34+～41周，中位數(shù)孕周37周。28～34周正常妊娠組：選擇同期門診妊娠28～34周正常妊娠婦女，本次妊娠期間無異常。共20例，年齡25～32歲，中位數(shù)年齡29歲，中位數(shù)孕周33周。>34周正常妊娠組：同期門診和住院的大于34周的妊娠婦女共 20例，年齡24～33歲，中位數(shù)年齡27歲，孕周34+～41周，中位數(shù)孕周37周。上述4組婦女的年齡、孕次、產(chǎn)次比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組婦女既往均無高血壓、糖尿病、腎炎、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參照樂杰主編《 婦產(chǎn)科學(xué)》 教材第 7版診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 異硫氰酸酯(FITC) 熒光標(biāo)記鼠抗人抗體CD4、藻紅蛋白(PE) 標(biāo)記的鼠抗人抗體CD25、藻紅蛋白-青色素染料5(PE-Cy5) 標(biāo)記的抗人抗體Foxp3、細(xì)胞固定劑和透膜劑等均購自美國eBioscience公司；淋巴細(xì)胞分離液購自聯(lián)科生物公司。FACScalibur流式細(xì)胞儀購自美國Becton-Dickinson公司。

1.2.2 標(biāo)本的采集 采集所有孕婦靜脈血3 mL，肝素鈉抗凝，所有標(biāo)本在采集后4 h內(nèi)測定。用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，用PBS調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL。1.2.3 細(xì)胞染色和流式細(xì)胞術(shù)分析 取3支試管，分別加入上述細(xì)胞懸液100 μL，第2、3管各加入抗人CD4-FITC抗體 20 μL和抗人CD25-PE抗體20 μL，第1管加入相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照20 μL，混勻后避光孵育30 min，用預(yù)冷的流式細(xì)胞緩沖液洗1次，每管各加入1 mL新鮮準(zhǔn)備的固定液重懸混勻，4 ℃避光孵育30 min，2 000×g離心5 min后棄上清液，用預(yù)冷的流式細(xì)胞緩沖液洗細(xì)胞1次，用1 mL透膜劑重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育30 min，2 000×g離心5 min后棄上清液，用預(yù)冷的流式細(xì)胞緩沖液洗細(xì)胞1次，再于第3管加入抗人Foxp3-PE-Cy5抗體20 μL，第2管加入相對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照20 μL，4 ℃避光孵育30 min，2 000×g離心5 min后棄上清液，將細(xì)胞重懸于500 μL流式細(xì)胞緩沖液中，立即上機(jī)檢測。

2 結(jié) 果

早發(fā)型子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)率低于28～34周正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。晚發(fā)型子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg與大于34周正常妊娠組婦女比較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。早發(fā)型子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg低于晚發(fā)型子癇前期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。28～34周與大于34周正常妊娠組婦女外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組孕婦外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)率比較，見表1。

表1 4組孕婦外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)率(%)

a：P<0.01，與晚發(fā)型子癇前期比較；b：P<0.01，與28～34周正常妊娠組比較；c：P<0.05，與大于34周正常妊娠組比較。

3 討 論

盡管子前期的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但研究顯示子癇前期患者普遍發(fā)生免疫異常：子癇前期患者體內(nèi)抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體、免疫復(fù)合物和補(bǔ)體增加，Th1/Th2比值向誘導(dǎo)免疫排斥的Th1偏移，炎癥細(xì)胞及炎癥因子增加，提示子癇前期是一種母胎免疫耐受不良性疾病[1-3]。

妊娠中胎兒作為一種同種半異體抗原能夠在母體內(nèi)生存、發(fā)育和生長而不被排斥，是由于母體免疫耐受機(jī)制能確保阻止母體對(duì)胎兒的免疫攻擊。母胎免疫耐受的誘導(dǎo)和維持涉及諸多因素，諸如，輔助性T淋巴細(xì)胞Th1/Th2平衡、CD95及其配體的相互作用、胎盤人類白細(xì)胞(HLA)的表達(dá)等。近年來許多研究表明，機(jī)體可能更主要的是通過Treg抑制自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞來誘導(dǎo)母胎免疫耐受而維持妊娠[4-6]。人體研究顯示：正常妊娠婦女循環(huán)系統(tǒng)及蛻膜中均含CD4+CD25+Treg，早期增高,妊娠中期達(dá)高峰，產(chǎn)后降低[7-8]。原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血和脫膜中CD4+CD25+T細(xì)胞顯著低于正常早孕婦女[9]，且CD4+CD25+T對(duì)CD4+CD25-T增殖抑制能力降低[10]。

Treg是機(jī)體維持外周免疫耐受自然機(jī)制的決定因素。Treg和炎癥細(xì)胞之間的平衡將決定免疫應(yīng)答是否發(fā)生、免疫耐受是否形成。Treg包括兩大類，第1類是胸腺來源的天然 Treg，即CD4+CD25+T細(xì)胞，它在健康人中占CD4+T細(xì)胞的1%～10%；第2類是外周誘導(dǎo)的獲得性Treg，包括Th3細(xì)胞、Tr1細(xì)胞等。Treg主要表型標(biāo)記包括CD25、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4),糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白(GITR)，F(xiàn)oxp3。其中Foxp3的mRNA及其編碼蛋白僅特異性表達(dá)于 CD4+CD25+Treg，其他CD4+T細(xì)胞亞群均極少表達(dá)Foxp3及其編碼分子[11]，因此，F(xiàn)oxp3是最適宜的 Treg鑒定標(biāo)記。Foxp3還是控制 Treg發(fā)育及其功能效應(yīng)的關(guān)鍵[12]。

目前已有數(shù)個(gè)子癇前期外周血Treg的研究,但缺乏關(guān)于早發(fā)型子癇前期外周血Treg 方面的分層研究。Sasaki等[13]發(fā)現(xiàn)子癇前期患者CD4+CD25+Treg減少，并且證明CD4+CD25brigtTreg主要是Foxp3+細(xì)胞。曹霞等[14]研究發(fā)現(xiàn)各種病情的子癇前期患者的外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg表達(dá)水平均明顯低于正常妊娠晚期組。同時(shí)，不同病情子癇前期患者之間，這兩項(xiàng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)水平也有顯著區(qū)別，輕度子癇前期患者的外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg水平均低于重度子癇前期。但Prins等[15]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期患者CD4+CD25+Foxp3+Treg比例與正常妊娠婦女類似，CD4+CD25high Foxp3+Treg比例也不存在顯著下降，但早產(chǎn)子癇前期患者(孕周小于37周)CD4+Treg比例顯著低于相對(duì)應(yīng)孕周正常妊娠婦女，他們認(rèn)為CD4+Treg更能反應(yīng)Treg的狀態(tài)。

也有研究提示子癇前期與外周血CD4+CD25+Treg變化并無相關(guān)性[16]。但由于表面標(biāo)志CD25、CTLA4、GITR也動(dòng)態(tài)表達(dá)于激活的CD4+Th細(xì)胞，因此，僅僅依靠這些表型很難區(qū)別新近激活的CD4+Th細(xì)胞和Treg，尤其是妊娠時(shí)候，CD4+細(xì)胞存在對(duì)表達(dá)在胎兒細(xì)胞的父方抗原發(fā)生的正常激活反應(yīng)。

有鑒于此，在本研究中，選擇Foxp3作為Treg特異標(biāo)志，分別以早發(fā)型子癇前期患者、晚發(fā)型子癇前期患者作為研究對(duì)象，并以孕周相對(duì)應(yīng)的正常孕婦作為對(duì)照，采用流式細(xì)胞儀檢測外周血單個(gè)核細(xì)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比率,發(fā)現(xiàn)早發(fā)型和晚發(fā)型子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例均低于其對(duì)應(yīng)孕周正常妊娠組婦女外周血 CD4+CD25+Foxp3+Treg比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且相對(duì)于晚發(fā)型子癇前期患者，早發(fā)型子癇前期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例進(jìn)一步減少，而與早發(fā)型和晚發(fā)型子癇前期孕周分別對(duì)應(yīng)的正常妊娠婦女外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示CD4+CD25+Foxp3+Treg減少參與了子癇前期的發(fā)病，而且其下降程度與發(fā)病孕齡密切相關(guān)。外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的減少可能使子癇前期患者免疫耐受調(diào)控機(jī)制受損，使得針對(duì)胎兒父方抗原成分的效應(yīng)細(xì)胞及分子增加，打破了機(jī)體免疫反應(yīng)與免疫耐受之間的平衡，從而引起母體免疫損傷，導(dǎo)致了子癇前期的發(fā)生。

子癇前期中，又以孕34周前發(fā)病的早發(fā)型子癇前期危害嚴(yán)重。目前終止妊娠仍是子癇前期治療的主要手段，由于早發(fā)型子癇前期孕齡小、胎兒不成熟，極低體重兒和超低體重兒的死亡率高，常常使得臨床處理很難兼顧母嬰安全。因此，探討Treg與子癇前期發(fā)現(xiàn)孕周的關(guān)系尤為重要。基于本次研究的結(jié)論，CD4+CD25+Foxp3+Treg有望成為早發(fā)型子痢前期患者的實(shí)驗(yàn)室診斷的新指標(biāo)及免疫治療的新思路,如靜脈輸注免疫球蛋白、抗TNF的阻斷劑等[4]。為了進(jìn)一步明確Treg在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用，應(yīng)該進(jìn)一步研究子癇前期發(fā)病前是否存在Treg的下降。

[1]Darmochwal-Kolarz D,Saito S,Rolinski J,et al.Activated T lymphocytes in pre-eclampsia[J].J Reprod Immunol,2007,58(1):39-45.

[2]Schiessl B.Inflammatory response in preeclampsia[J].Mol Aspects Med,2007,28(2):210-219.

[3]Saito S,Shiozaki A,Nakashima A.The role of the immune system in preeclampsia[J].Mol Aspects Med,2007,28(2):192-209.

[4]Zenclussen AC.Regulatory T cells in pregnancy[J].Springer Semin Immunopathol,2006,28(1):31-39.

[5]Leber A1,Teles A,Zenclussen AC.Regulatory T cells and their role in pregnancy[J].Am J Reprod Immunol,2010,63(6):445-459.

[6]Alijotas-Reig J.Potentiating maternal immune tolerance in pregnancy:A new challenging role for regulatory T cells[J].Placenta,2014,35(4):241-248.

[7]王軼英.正常妊娠孕婦外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞比例的變化[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008,27(3):20-21.

[8]Somerset DA,Zheng Y,Kilby MD,et al.Normal human pregnancy is associated with an elevation in the immune suppressive CD25+CD4+regulatory T-cell subset[J].Immunology,2004,112(1):38-43.

[9]邱麗華，林其德，沈仲毅，等.調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2004,39(12):816-818.

[10]劉雨生，趙淑云，季靜娟，等.原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞比例及功能的測定[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2007,42(3):176-179.

[11]Fehervari Z,Sakaguchi S.Control of Foxp3+CD25+CD4+regulatory cell activation and function by dendritic cells[J].Int Immunol,2004,16(12):1769-1780.

[12]Hori S,Nomura T,Sakaguchi S.Control of Regulatory T Cell Development by the Transcription Factor Foxp3[J].Science,2003,299(5609):1057-1061.

[13]Sasaki Y,Darmochwal-Kolarz D,Suzuki D,et al.Proportion of peripheral blood and decidual CD4+CD25(bright) regulatory T cells in pre-eclampsia[J].Clin Exp Immunol,2007,149(1):139-145.

[14]曹霞，王蓮蓮，梁杰.子癇前期孕婦外周血調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞差異表達(dá)的臨床意義[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2010,29(6)：621-622.

[15]Prins JR,Boelens HM,Heimweg J,et al.Preeclampsia is Associated with Lower Percentages of Regulatory T Cells in Maternal Blood[J].Hypertens Pregnancy,2009,28(3):300-311.

[16]Paeschke S,Chen F,Horn N,et al.Pre-eclampsia is not associated with changes in the levels of regulatory T cells in peripheral blood[J].Am J Reprod Immunol,2005,54(6):384-389.

驗(yàn)交流·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.21.029

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(2008A147)。 作者簡介：張莉英(1969-)，碩士，主任醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科方面的研究?！?/p>

,E-mail:zly2028@126.com。

R71

B

1671-8348(2015)21-2965-03

2015-02-11

2015-04-04)