李東云，張巍瓊，顧玲麗，吳 洋

(1.云南省昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011)

益腎養(yǎng)陰合劑對MRL/lpr小鼠免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究

李東云1，張巍瓊1，顧玲麗1，吳 洋2△

(1.云南省昆明市中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650011)

目的 探討益腎養(yǎng)陰合劑對MRL/lpr小鼠中的CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-l0的影響。揭示益腎養(yǎng)陰合劑對MRL/lpr小鼠免疫紊亂發(fā)揮療效作用的調(diào)節(jié)。方法 將C57BL/6雄性小鼠分2組，第1組生理鹽水對照；第2組正常中藥組(益腎養(yǎng)陰合劑)。再將 MRL/1pr 雄性小鼠隨機(jī)分為4組：第3組為生理鹽水對照組；第4組為中藥組(益腎養(yǎng)陰合劑)；第5組為中西藥組(益腎養(yǎng)陰合劑+醋酸潑尼松片)；第6組為西藥組(醋酸潑尼松片)。各組小鼠均為10只。予每日灌胃連續(xù)治療4周。4周后處死，取各組小鼠(每組取5只)新鮮脾臟組織進(jìn)行研磨、淋巴細(xì)胞分離后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+、CD8+細(xì)胞比例；再取余下各組5只小鼠新鮮脾臟組織為兩部分，一部分用ELISA法檢測組織IL-10、IFN-γ濃度；另一部分運(yùn)用RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測IL-10、IFN-γmRNA含量。結(jié)果 1.4組MRL/1pr小鼠CD4+較C57BL/6小鼠低且治療后以中藥加激素組升高明顯(P<0.05)；4組MRL/1pr小鼠CD8+較C57BL/6小鼠高，在治療后，中藥加激素組較MRL/1pr小鼠生理鹽水組降低(P<0.05)；CD4+/CD8+的比值中4組MRL/1pr小鼠與C57BL/6治療前無差異且MRL/1pr比值最低，給予治療后以MRL/1pr中藥配合激素組升高最為明顯(P<0.05)。2.MRL/1pr小鼠IL-10較C57BL/6小鼠有不同程度升高，經(jīng)治療后以中藥配合西藥組降低明顯(P<0.05)；MRL/1pr小鼠IFN-γ較C57BL/6小鼠有不同程度降低，經(jīng)治療后以中藥配合西藥組升高明顯(P<0.05)；IL-10 mRNA、IFN-γ mRNA的表達(dá)6組間比較差異性與蛋白變化(ELISA結(jié)果)一致。結(jié)論 益腎養(yǎng)陰合劑可通過對CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-10的調(diào)節(jié)緩解MRL/1pr小鼠病情，且治療調(diào)節(jié)了CD4+/CD8+比例，說明益腎養(yǎng)陰合劑對調(diào)節(jié)MRL/1pr小鼠免疫紊亂具有一定療效。

益腎養(yǎng)陰合劑；MRL/1pr小鼠；免疫調(diào)節(jié)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是自身免疫介導(dǎo)的，以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病。流行病學(xué)研究顯示，我國患病率為70/10萬，婦女中則高達(dá)113/10萬人，其5年存活率為90%，10年存活率為80%[1]。通常以皮膚損害的紅斑為主稱為“陰陽毒”。闡明免疫細(xì)胞的機(jī)制研究對SLE的發(fā)病作用，探尋新的治療靶點(diǎn)及制定個(gè)性化治療方案有著重要的意義。

益腎養(yǎng)陰合劑是根據(jù)云南省中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科常見的協(xié)定方藥，該方具有益氣固腎、養(yǎng)陰清熱之功效，其主要組方為黃芪生脈六味二至丸加減化裁而成(黃芪、黨參、麥冬、五味子、女貞子、旱蓮草、熟地、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓、金櫻子、甘草)。該方在臨床上使用證實(shí)具有益氣固腎、養(yǎng)陰清熱，治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相應(yīng)免疫調(diào)節(jié)作用。本文就是探索該方是否對免疫紊亂具有調(diào)節(jié)作用的功效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及動物 純種6～8 周MRL/1pr 雄性小鼠，40只,體重(28.0±3.0) g, C57BL/6背景小鼠6～8周,雄性20只(與MRL/1pr小鼠為同種系)，SPF級,2種小鼠均由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供(由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn))，許可證號：SCXK(蘇)2010-0001。益腎養(yǎng)陰合劑(黃芪30 g，黨參20 g，麥冬20 g，五味子10 g，女貞子15 g，墨旱蓮15 g，熟地15 g，山藥15 g，山茱萸10 g，澤瀉10 g，牡丹皮10 g，茯苓15 g，金櫻子10 g，甘草5 g)共200 g。中藥由云南省中醫(yī)醫(yī)院煎藥房統(tǒng)一煎煮，4℃冰箱保存。醋酸潑尼松片，由云南省中醫(yī)醫(yī)院藥房提供，(重慶科瑞制藥(集團(tuán))有限公司，批號：H50020459，規(guī)格：5mg/片)。

1.2 試劑與儀器 高速微量離心機(jī)、酶標(biāo)儀(Molecular Devices)、核酸蛋白檢測儀、流式細(xì)胞儀(CyFlow Space)、IFN-γ ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒(美國RayBiotech，Inc)、Rat anti mouse CD4 流式抗體、Rat anti mouse CD8 流式抗體(北京四正柏)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組與給藥

2.1.1 藥物制備 中藥煎煮加800 mL水，煎煮20 min后，煎煮得到200 mL中藥湯劑。小鼠每次給藥為0.3 mL/20 g體重[2](相當(dāng)于生藥量1.15 g/mL)。成人激素量為5 mg/d，則小鼠激素用量為0.013 mg/20 g ,則用激素量加蒸餾水制備0.3 mL/20 g懸液。

2.1.2 動物分組以及給藥方式 兩種同種系不同品種小鼠共分為6組，每組10只。將C57BL/6雄性小鼠分2組，第1組生理鹽水對照；第2組正常中藥組(益腎養(yǎng)陰合劑)。再將MRL/1pr雄性小鼠隨機(jī)分為4組：第3組為生理鹽水對照組；第4組為中藥組(益腎養(yǎng)陰合劑)；第5組為中西藥組(益腎養(yǎng)陰合劑+醋酸潑尼松片)；第6組為西藥組(醋酸潑尼松片)。各組小鼠均為10只。予以每日灌胃連續(xù)治療28 d。

2.2 標(biāo)本制備 給藥4周后，在無菌RNase環(huán)境下，用腹腔麻醉小鼠(0.001ml/g體重)，分離取材各組5只小鼠脾臟組織，一部分放入無菌Rnase的EP管中，用作RT-PCR實(shí)驗(yàn)，一部分放入無菌的EP管中，用作ELISA實(shí)驗(yàn)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+細(xì)胞比例 (1)將各組5只小鼠脫頸處死，在超凈臺中分離出小鼠脾臟，無菌操作；進(jìn)行脾臟研磨，室溫離心，吸出淋巴細(xì)胞層再室溫離心收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)；(2)取上述制備好的小鼠淋巴細(xì)胞，每只小鼠的脾臟細(xì)胞平均分為A、B、C、D 4管，A管為空白管，B管中加入10 μL CD4-FITC流式抗體，C管中加入10 μLCD8-PE流式抗體，D管中各加入CD4-FITC和CD8-PE流式抗體，均與管底細(xì)胞混勻，室溫避光孵育20 min；制成單細(xì)胞懸液，上流式細(xì)胞儀檢測CD4+，CD8+。

2.4 ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

2.4.1 樣本制備 取出備用脾臟組織，裂解后上超聲細(xì)胞破碎儀冰浴上勻漿至均勻無顆粒，取上清。

2.4.2 操作步驟 準(zhǔn)備試劑，在酶標(biāo)板上每孔對應(yīng)加入樣品、標(biāo)準(zhǔn)品。4℃孵育過夜，加入檢測抗體，室溫孵育1h ，加入100μL 工作液，室溫孵育45min，加入100μL 底物試劑，室溫孵育30min，每孔加入50μL終止液，酶標(biāo)儀上450nm波長處讀數(shù)。

2.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測IL-10、IFN-γ mRNA含量 查找mouse的IFN-γ和IL-10的mRNA序列，送交廣州合成。提取總RNA，合成cDNA第一條鏈，再用PCR法擴(kuò)增目的基因，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，運(yùn)用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像，用Image J軟件測量灰度值，最后測目的基因和內(nèi)參β-actin電泳條帶灰度值的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 流式檢測結(jié)果 見表1、圖1。

表1 各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+細(xì)胞的流式檢測結(jié)果

圖1 各組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+細(xì)胞的流式檢測圖

3.2 ELISA檢測IL-10和IFN-γ結(jié)果 表2。

表2 各組小鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ ELISA檢測結(jié)果

3.3 RT-PCR檢測IL-10和IFN-γ mRNA結(jié)果 見表3、圖2。

表3 各組小鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ RT-PCR灰度值比值分析結(jié)果(目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值，

注：*表示與C57BL/6+生理鹽水組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05；○表示與C57BL/6+中藥組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05；●表示與MRL/1pr+生理鹽水組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；△表示與MRL/1pr+中藥組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05；▽表示與MRL/1pr +中藥聯(lián)合激素組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；▲表示與MRL/1pr+激素組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05。

圖2 各組小鼠脾臟組織中IL-10、IFN-γ mRNA基因表達(dá)情況

(泳道1代表C57BL/6+生理鹽水組；泳道2代表C57BL/6+中藥組；泳道3代表MRL/1pr+生理鹽水組；泳道4代表MRL/1pr+中藥組；泳道5代表MRL/1pr+中藥聯(lián)合激素組；泳道6代表MRL/1pr+激素組)

4 討論

本次研究選擇的細(xì)胞因子IFN-γ[3]及IL-10[4]，CD4+、CD8+在當(dāng)今的SLE研究中出現(xiàn)對Th1/Th2的比值的影響較為廣泛。通過調(diào)節(jié)外周血Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡及提高CD4+/CD8+的比值可增強(qiáng)免疫應(yīng)答已經(jīng)是一個(gè)趨勢，同時(shí)反向調(diào)節(jié)作用即通過CD4+/CD8+的比值反映Th1/Th2，輔助T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性細(xì)胞的損傷的不平衡已經(jīng)提出能夠參與自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)中IFN-γ水平的下降和IL-10水平的增高顯然是有聯(lián)系的，但根據(jù)筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只能顯示兩者之間的負(fù)相關(guān)，而不能推斷它們的因果關(guān)系，IFN-γ下降或者是IL-10增高的先后順序及誰起先導(dǎo)作用則待進(jìn)一步完善研究。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，中藥配合激素對MRL/lpr小鼠CD4+/CD8+比值具有一定調(diào)節(jié)作用，也反映其Th1與Th2的比值可受反向調(diào)節(jié)分析存在可能，但Th1與Th2的分泌活動復(fù)雜，這也許只能為其中一項(xiàng)指標(biāo)。了解Th1與Th2之間是否存在因果關(guān)系，對該病診斷、療效等開辟新方向。

[1]中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會.系統(tǒng)紅斑狼瘡診斷及治療指南[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2010,14(5):342-346.

[2]熊遠(yuǎn)珍.實(shí)驗(yàn)動物與人用藥量的新?lián)Q算[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1997,12(30):41.

[3]McMurray RW,Hoffman RW, Nelson W,Walker SE.Cytokine mRNA expression in the B/W mouse model of systemic lupus erythematosuseanalyses of strain,gender,and age effects[J].Clin Immunol Immunopathol,1997,84:260-268.

[4]Chong W.P,Ip W.K,Wong W.H,et al. Association of interleukin-10 promoter polymorphisms with systemic lupus erythematosus[J].Genes Immun,2004,5(6):484-492.

Study on the Effect of Yishen Yangyin Mixture on the Immune Regulation Mechanism of MRL/lpr Mice

LI Dong-yun1, ZHANG Wei-qiong1, GU Ling-li1, WU Yang2

(1.TraditionalChineseMedicineHospitalofKunmingCity,Kunming650000,Yunnan; 2.YunnanTraditionalChineseMedicineHospital,Kunming650000,Yunnan)

Objective: To study the effect of Yishen Yangyin Mixture (YYM) on CD4+, CD8+, IFN-γ and IL-l0 of MRL/lpr mice and reveal its regulation effect on immune disorders of MRL/lpr mice. Methods: C57BL/6 male mice were divided into two groups, the 1st saline group and the 2nd normal YYM group, and MR /1pr male mice were randomly divided into 4 groups, the 3rd normal saline group, the 4th YYM group, the 5th YYM+ prednisone tablet group and the 6th prednisone tablet group, 10 mice per group. Each group was fed daily for 4 consecutive weeks. Four weeks later, the mice were killed to get fresh spleen tissue from 5 mice to be grinded and after separation of lymphocytes, flow cytometry was used to measure CD4+, CD8+cell ratio. Then another fresh spleen tissue were taken from the remaining five mice and divided into two parts. One part was used to assay IL-10 and IFN-γ concentration by ELISA and the other part to assay IL-10 and IFN-γmRNA content by RT-PCR. Results: A. After the treatment, CD4+of the 4th group increased significantly (P<0.05) when compared with that of the 6th group, and CD8+of the 4th group was higher than that of the 6th group and lower than that of the 1st group(P<0.05). The CD4+/CD8+ratio of the 4th group had no obvious difference before the treatment and the ratio of MRL / 1pr mice was lowest, but increased obviously(P<0.05)after the treatment. B. IL-10 of MRL/1pr mice increased to varying degrees when compared with that of C57BL/6 mice, and after the treatment, IL-10 of the 5th group was significantly lower (P<0.05). IFN-γ of MRL/1pr mice reduced to varying degrees when compared with that of C57BL/6 mice and after the treatment, IFN-γ of the 5th group increased significantly (P<0.05). In comparison of IL-10 mRNA presentation of these 6 groups, difference and protein changes (ELISA result) were consistent. Conclusion: Yishen Yangyin Mixture can regulate CD4+, CD8+, IFN-γ and IL-10 to remit the illness of MR /1pr mice, and adjust CD4+/CD8+ratio, thus indicating that Yishen Yangyin Mixture has a adjusting effect on the immune disorders of MRL /1pr mice.

Yishen Yangyin Mixture, MRL/1pr mouse, immunomodulatory

李東云(1987-)，女，湖北，研究方向：中醫(yī)痹證。

△通信作者：吳洋，Tel：13187705354，E-mail：451886900@qq.com

R285.5

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1007-2349(2015)08-0071-04

2015-07-03)