徐士奎，張雯潔，羅艷秋，陶 靜

(1.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500)

高效液相色譜法測定小兒導(dǎo)赤片中大黃素和大黃酚的含量*

徐士奎1，張雯潔1，羅艷秋2，陶 靜3

(1.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500)

目的 建立小兒導(dǎo)赤片中大黃素、大黃酚含量測定的高效液相色譜法；方法 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)為流動相，檢測波長為254nm；結(jié)果 大黃素在4.072-40.72μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為95.84%；大黃酚在10.41-104.142μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率為96.40%。結(jié)論 HPLC法能準(zhǔn)確進行定量分析大黃素和大黃酚兩種物質(zhì)的含量。

小兒導(dǎo)赤片；大黃素；大黃酚；高效液相色譜

小兒導(dǎo)赤片是由大黃、梔子、滑石、地黃、甘草、木通、茯苓等7味藥材加工制成的純中藥制劑，有清熱利便的功效，治療口舌生瘡、咽喉腫痛、牙根出血、腮頰腫痛、爆發(fā)火眼、大便不利、小便赤黃等病癥[1]，療效顯著。方中大黃苦寒瀉下，蕩滌胃腸積滯，為君藥；木通上清心經(jīng)之熱，下則清利小腸，梔子清熱瀉火，為臣藥；地黃涼血滋陰，為佐藥；生甘草清熱解毒，調(diào)和諸藥，為使藥?，F(xiàn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十九冊，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅包括性狀、鑒別、檢查、功能主治、用法用量、貯藏等項目，其中鑒別為大黃對照藥材薄層色譜法[1]。原標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重缺項，未能夠有效控制藥品質(zhì)量，需要對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行深入研究。肖培云等[2]曾經(jīng)運用高效液相色譜法對小兒導(dǎo)赤片中大黃素和大黃酚進行含量測定研究，筆者對其方法進行驗證，發(fā)現(xiàn)該方法重現(xiàn)性差且色譜峰的峰形和分離度等均達不到《中國藥典》[3]方法學(xué)研究的要求，其樣品測定結(jié)果僅為大理白族自治州中藥制藥有限責(zé)任公司1家企業(yè)樣品，無法反映小兒導(dǎo)赤片的整體質(zhì)量狀況。為更好的保證藥品質(zhì)量，筆者重新建立高效液相色譜法對小兒導(dǎo)赤片中大黃素、大黃酚同時進行含量測定研究。

1 儀器、試藥與樣品

1.1 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)，檢測器：SPD-20A(D2+W))；紫外分光光度計(島津UV-2550)；分析天平(Denver TB-215D，十萬分之一)；分析天平(SartorIUS BS224S，萬分之一)

1.2 試藥 對照品為大黃素(中國藥品生物制品檢定所，110796-201017，100%)、大黃酚(中國藥品生物制品檢定所，110756-200110，99.6%)；方法學(xué)研究用小兒導(dǎo)赤片樣品均由云南白藥集團麗江藥業(yè)提供；甲醇由Merck公司生產(chǎn)，色譜純；水為超純水；磷酸為分析純；乙酸乙酯、無水乙醇、95%乙醇、三氯甲烷等均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)為流動相，檢測波長為254 nm，理論板數(shù)按大黃素峰計算應(yīng)不低于2000。

2.2 對照品貯備溶液的制備 精密稱取大黃素對照品5、09 mg，大黃酚對照品13.07 mg，置50 mL容量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯(2：1)混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備溶液。對照品HPLC圖譜見圖1。

圖1 對照品HPLC色譜圖

2.3 供試品溶液制備 取小兒導(dǎo)赤片樣品20片，精密稱定重量，研細(xì)，精密加入95%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，置水浴上加熱回流1 h，冷卻，用95%乙醇補足減失的重量，濾過，精密量取濾液10 mL至燒瓶內(nèi)，置水浴上蒸干，殘渣加30%的乙醇-鹽酸(10：1)混合溶液15 mL，加熱回流提取1 h，立即冷卻，用三氯甲烷強烈振搖提取4次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，置水浴上蒸干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯(2：1)混合溶液溶解，移至25 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。樣品HPLC圖譜見圖2。

圖2 樣品HPLC色譜圖

2.4 陰性供試品溶液制備 按處方量取缺大黃的其余藥材模擬制劑工藝制備陰性樣品，由云南白藥集團麗江藥業(yè)制備。取小兒導(dǎo)赤片缺大黃的陰性樣品20片按2.3項下供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。陰性樣品HPLC圖譜見圖3。

圖3 陰性樣品HPLC色譜圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取儲備液，加無水乙醇-乙酸乙酯(2：1)溶液制成分別含大黃素濃度為4.072、8.144、10.180、20.36、30.54、40.72 μg/mL，大黃酚濃度為10.414、20.828、26.035、52.071、78.100、104.142 μg/mL的混合對照品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，大黃素的回歸方程為Y=38.6x+0.0362，r=0.9999，表明大黃素在4.072-40.72 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；大黃酚的回歸方程為Y=53.731x+5.8485，r=0.9999，表明大黃酚在10.414-104.142 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 儀器精密度實驗 取同一對照品溶液(大黃素濃度為10.180 μg/mL，大黃酚濃度為26.035 μg/mL)，按照2.1項下的液相色譜條件重復(fù)進樣6次(n=6)，每次進樣10 μL，大黃素和大黃酚峰面積的RSD值分別為0.03%與0.02%，均<2%，表明儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 精密稱取小兒導(dǎo)赤片細(xì)粉0.5008 g，按2.3項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL分別在室溫下放置0、2、6、9、13、17 h后進樣，按照2.1項下的色譜條件依法測定，大黃素和大黃酚的RSD分別為0.44%與0.50%，表明供試品溶液在17 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批次小兒導(dǎo)赤片樣品細(xì)粉6份，按2.3項下供試品溶液制備方法處理后進行含量測定，按照外標(biāo)法計算各樣品中大黃素和大黃酚的含量，RSD值分別為1.83%和1.82%，說明重復(fù)性良好。

2.5.5 耐用性試驗

2.5.5.1 提取溶劑的選擇 取樣品分別采用50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇、95%乙醇進行提取，結(jié)果顯示甲醇與95%乙醇的提取效果明顯優(yōu)于50%乙醇、50%甲醇、70%乙醇，而甲醇和95%乙醇之間無明顯差別，且甲醇對人視覺有傷害，95%乙醇價格相對便宜，故選用95%乙醇。

2.5.5.2 提取方法與提取時間優(yōu)化 比較超聲提取30 min、超聲提取1 h、回流提取30 min、回流提取1 h、冷浸12 h、冷浸24 h等提取條件，結(jié)果超聲提取1 h、冷浸24 h、回流提取30 min的提取率明顯低于回流提取1 h，故選擇加熱回流提取的方式進行提取；通過比較回流提取30 min、1、2 h等不同提取時間的提取效率，發(fā)現(xiàn)回流提取1 h與2 h的提取效果明顯優(yōu)于30 min，而提取1 h與提取2 h的提取效果基本無差別，表明回流處理1 h能提取完全。

2.5.5.3 色譜條件的優(yōu)化 取樣品溶液，分別采取不同比例的流動相進行測定，結(jié)果表明以甲醇-0.1%磷酸水溶液(79：21)為流動相時被測成分色譜峰的分離度及峰形較好；對不同品牌、不同規(guī)格的色譜柱及不同柱溫進行優(yōu)化測定，結(jié)果表明對被測成分色譜峰的分離度及測定結(jié)果無明顯影響。

2.5.6 回收率試驗 精密稱取含量已知的小兒導(dǎo)赤片細(xì)粉6份，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入大黃素、大黃酚對照品適量，按2.3項下供試品溶液制備方法及2.1項下的色譜條件依法測定含量并計算回收率，大黃素平均回收率為95.84%，RSD=0.62%；大黃酚平均回收率為96.40%，RSD=0.98%，表明該方法的回收率良好，結(jié)果見表1、表2。

2.6 樣品測定 目前生產(chǎn)小兒導(dǎo)赤片主要有長春人民藥業(yè)集團有限公司、大理白族自治州中藥制藥有限公司、廣西天天樂藥業(yè)股份有限公司、云南白藥集團麗江藥業(yè)有限公司等四家生產(chǎn)企業(yè)，為充分了解各家企業(yè)生產(chǎn)小兒導(dǎo)赤片的質(zhì)量狀況，課題組對4家企業(yè)共10批次樣品進行含量測定研究，結(jié)果見表3。

表1 大黃素回收率結(jié)果

表2 大黃酚回收率結(jié)果

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 本實驗采用HPLC法同時測定小兒導(dǎo)赤片中大黃素、大黃酚的含量，該方法分離度好，靈敏度高且穩(wěn)定性好，可作為其質(zhì)量控制方法。

3.2 本實驗對目前生產(chǎn)小兒導(dǎo)赤片的4家生產(chǎn)企業(yè)提供的樣品進行測定研究，發(fā)現(xiàn)小兒導(dǎo)赤片的含量不僅在各家企業(yè)之間存在較大差距，而且同一企業(yè)生產(chǎn)的不同批次樣品也存在一定差異，非常有必要對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行提高研究。

3.3 大黃素在289 nm出現(xiàn)最大吸收峰，大黃酚在254 nm處有最大吸收，但驗證發(fā)現(xiàn)254 nm處與289 nm處的吸收峰比較接近，樣品溶液的信號響應(yīng)值在254 nm時強于289 nm時，且其他成分在254 nm波長處測定無干擾，靈敏度較高，故測定波長選定為254 nm。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十九冊，1998，16.

[2]肖培云等.HPLC同時測定小兒導(dǎo)赤片中大黃素、大黃酚的含量[J]. 中成藥，2008(30)，280.

[3]衛(wèi)生部.中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：231-232，22，附錄130-131.

國家社會科學(xué)基金西部項目“彝族醫(yī)藥文化遺產(chǎn)保護與傳承研究”(NO：12XMZ077)及2011-2012年度國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高項目(NO：WX-11-83)資助。

徐士奎(1980～)，男，主管藥師，藥學(xué)博士，研究方向：彝族傳統(tǒng)醫(yī)藥知識體系、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、彝藥資源學(xué)。

R284

A

1007-2349(2015)08-0074-03

2015-06-11)