谷志龍 姜華茂 胡占升

急性肺損傷（Acute Lung Injury，ALI）是在創(chuàng)傷、重癥感染、休克等等非心源性疾病過(guò)程中，肺泡上皮細(xì)胞和肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷造成的彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭[1]；脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的ALI在重癥感染后早期出現(xiàn)[2]，并且死亡率較高[3]。Toll like receptors（TLRs）家族和先天性免疫系統(tǒng)關(guān)系比較密切[4]，其中TLR4目前研究最多，是LPS受體[5]。本實(shí)驗(yàn)基于建造小鼠內(nèi)毒誘導(dǎo)ALI[6-7]，深入探討ALI、LPS和TLR4及TNF-α之間的關(guān)系及損傷機(jī)制，并可能為臨床ALI的預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和新方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料、儀器及試劑 DNA marker（大連寶生物）和引物（大連寶生物），梯度PCR儀器（德國(guó)Biometre公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠），DU800核算蛋白分析儀（德國(guó)BECKMAN COULTER公司），半干式轉(zhuǎn)膜儀，辣根標(biāo)記羊抗兔二抗（北京中杉金橋）兔抗小鼠TLR4抗體（SANTA），DNA及蛋白maker（大連寶生物），引物（大連寶生物）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)別的BALB/C雄性小鼠，體重30~35 g，隨機(jī)分成3組，每組10只，A組為正常對(duì)照組，不作任何處理；B組為急性肺損傷模型組：腹腔內(nèi)注射給予LPS（4 mg/kg）腹腔內(nèi)注射制備ALI模型；C組為抗體組：建造ALI模型前8~10 h給予TLR4/MD腹腔內(nèi)注射（50 μg）。在建造模型成功后各組小鼠無(wú)菌條件下取出肺組織和取小鼠血檢測(cè)內(nèi)毒素及TNF-α水平，一部分肺組織置于液氮冷凍后，在-80 ℃冰箱保存，為mRNA及蛋白表達(dá)的檢測(cè)，另外部分放置在4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h后，HE染色鏡下觀察小鼠肺組織形態(tài)改變。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)及試驗(yàn)方法

1.2.2.1 小鼠血內(nèi)毒素含量檢測(cè) 選用試劑盒（動(dòng)態(tài)濁度法-血漿內(nèi)毒素檢測(cè)試劑）的處理方法和步驟，處理血標(biāo)本，并應(yīng)用LPS監(jiān)測(cè)分析得出檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1.2.2.2 小鼠肺組織HE染色及形態(tài)改變 4%多聚甲醛中固定，浸潤(rùn)、經(jīng)過(guò)梯度脫水，透明化處理（二甲醛），石蠟包埋處理，各組切片6張，厚度約7 μm，HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)及病理變化；損害評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用Gloor等[8]方法。

1.2.2.3 小鼠肺組織TLR4基因表達(dá) 按照TAKALA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取總RNA。TLR4基因表達(dá)：通過(guò)分光光度儀測(cè)RNA280 nm/260 nmOD值，立即開(kāi)始進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，引物序列（TLR4），上游 5’-CCCTGAAAGGCTTGGTCT-3’；下游3’-GAGGTGTCHHTHHTCTAA-5’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度268 bp；引物序列（β-actin），上游 5’-AGGCATACAGGGACAGCA-3’；下游 3’-TACAGCAGGGTCAACCATTG-5’， 擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 534 bp。反應(yīng)體系：10×RT Buffer 1 μL，MgCl22 μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNase Inhibitor 0.25 μL，Oligo dT 0.5 μL，RNase FREE dH2O 3.75 μL，dNTP Mixture 1 μL，Total RNA 1 μL。 反 應(yīng)條件：32 ℃ 9 min，49.2 ℃ 32 min，97 ℃ 4 min，4 ℃ 4 min。cDNA為模板PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：5×PCR Buffer 10 μL，MgCl22 μL，dNTP Mixture 1 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各 1 μL，H2O 32.75 μL，Taq酶 0.25 μL；反應(yīng)條件：96 ℃6 min、（95 ℃ 30 s、49.2 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）33 cycle、72 ℃9 min。

1.2.2.4 小鼠肺組織TLR4蛋白表達(dá) 取小鼠肺組織進(jìn)行總蛋白的提取，提取后用BCA法進(jìn)行蛋白含量的檢測(cè)，檢測(cè)后進(jìn)行PAGE凝膠電泳，電泳分離60 min后，通過(guò)maker條帶選取約95 kd大小切膠，應(yīng)用半干轉(zhuǎn)膜方法，封閉60 min，經(jīng)過(guò)一抗、二抗孵育，ECL顯色，暗室內(nèi)曝光，Tannon Gis軟件分析測(cè)曝光底片光密度值。

1.2.2.5 小鼠血漿TNF-α雙抗夾心ELISA檢測(cè) 通過(guò)應(yīng)用ELISA檢測(cè)TNF-α試劑盒方法與流程進(jìn)行標(biāo)本處理及檢測(cè)，并在酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，各組的均數(shù)采取單因素方差分析，組間進(jìn)行兩兩比較LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 建模小鼠情況 各組小鼠觀察情況如下：A組無(wú)死亡小鼠，B組小鼠攻毒后最初僅異常活動(dòng)增多，隨后出現(xiàn)蜷縮、抱團(tuán)現(xiàn)象，刺激無(wú)反應(yīng)，不能進(jìn)食、水，腹部呼吸頻率快，死亡1只；C組小鼠變化同A組。

2.2 LPS含量檢測(cè) 和A組比較，B組（模型組）LPS水平顯著升高，C組LPS水平也呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，建模成功，見(jiàn)表 1、圖 1。表3、圖4、圖5。

表1 各組小鼠血漿內(nèi)毒素水平

圖1 各組小鼠血漿內(nèi)毒素水平

表3 各組小鼠TLR4 mRNA及Protein表達(dá)

2.3 小鼠肺組織HE染色鏡下觀察 小鼠攻毒造模后，鏡下肺泡水腫及腔內(nèi)紅染，肺泡間隔增厚并充血，視野可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)?？贵w組干預(yù)后小鼠肺組織狀況明顯改善，鏡下僅少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡及間隔水腫不明顯，見(jiàn)表2、圖2、圖3。

表2 各組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分

圖2 各組小鼠肺組織HE染色鏡下改變（×200）

圖3 各組小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分

2.4 各組小鼠TLR4基因的表達(dá) A組小鼠（正常對(duì)照組）肺組織內(nèi)僅有少量TLR4 mRNA表達(dá)。與A組比較，B組（模型組）TLR4 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），C組（抗體組）和B組比較，TLR4 mRNA表達(dá)呈下調(diào)（P<0.05），見(jiàn)

圖4 TLR4 mRNA表達(dá)

圖5 TLR4 mRNA及Protein表達(dá)結(jié)果

2.5 各組小鼠TLR4蛋白的表達(dá) A組小鼠（正常對(duì)照組）肺組織內(nèi)僅有少量TLR4 Protein表達(dá)。與A組比較，B組（模型組）TLR4 Protein表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），C組（抗體組）和B組比較，TLR4 Protein表達(dá)呈下調(diào)（P<0.05），見(jiàn)表4、圖5、圖6。

表4 各組小鼠TLR4 Protein表達(dá)

圖6 TLR4 Protein表達(dá)

2.6 各組小鼠TNF-α檢測(cè) TNF-α水平變化同TLR4 mRNA和Protein趨勢(shì)相同。C組（抗體組）的TNF-α水平明顯低于B組（模型組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表5、圖7。*與A組比較，P<0.05；#與B組比較，P<0.05

表5 各組小鼠TNF-α表達(dá)（x-±s）

圖7 TNF-α表達(dá)

3 討論

ALI/ARDS病死率極高，其致病原因主張分直接肺損傷和間接肺損傷[9]。直接肺損傷因素：誤吸，重癥肺炎，肺挫傷，再灌注及淹溺等；間接肺損傷因素：嚴(yán)重創(chuàng)傷伴休克，膿毒癥及大量輸血制品等[10]。LPS水平在導(dǎo)致ALI病死率高達(dá)70%~90%[11-12]，以往研究認(rèn)為，炎癥調(diào)控的強(qiáng)弱是NF-kB，其受LPS、缺氧、創(chuàng)傷等多種因素啟動(dòng)[13-14]，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子（如IL1、IL4、IL6、IL8、PAF）、黏附分子急性期反應(yīng)蛋白等進(jìn)行下游表達(dá)，從而產(chǎn)生一系列的SIRS生物學(xué)效應(yīng)。TLR4是先天性免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物主要受體，為L(zhǎng)PS主要受體[15]。近年，對(duì)于TLRs家族成員與疾病的關(guān)系研究愈發(fā)收到關(guān)注、尤其是TLR4[16]。

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備簡(jiǎn)單，可控性腔，重復(fù)率較高，同人類急性肺損傷相似。和正常對(duì)照組比較，模型組TLR4 mRNA、Protein及TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)，提示ALI發(fā)生機(jī)制可能和TLR4及TNF-α相關(guān)。和模型組比較，抗體組的TLR4介導(dǎo)LPS信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)，從而使炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子等減少，TNF-α水平下調(diào)，喪失了對(duì)LPS的反應(yīng)性，進(jìn)而產(chǎn)生耐受，故通過(guò)阻斷TLR4信號(hào)靶點(diǎn)的表達(dá)，降低其下游TNF-α水平，能夠增加LPS耐受性的產(chǎn)生和LPS導(dǎo)致的ALI。既往研究熱點(diǎn)主要是NF-kB、NO、IL1、黏附因子等下游分子的啟動(dòng)，而本實(shí)驗(yàn)從LPS受體蛋白TLR4作為研究靶點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)表明TLR4是控制ALI的瀑鏈?zhǔn)絊IRS的門(mén)戶蛋白。

綜上所述，膿毒血癥導(dǎo)致ALI，通過(guò)腹腔內(nèi)注射LPS動(dòng)物模型復(fù)制性較好；其損傷機(jī)制可能是LPS和TLR4受體結(jié)合，介導(dǎo)TNF-α信號(hào)途徑導(dǎo)致。通過(guò)干預(yù)TLR4受體靶點(diǎn)能夠下調(diào)TNF-α，減輕臨床癥狀，這位臨床對(duì)于膿毒血癥所致ALI提供新的治療思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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