韋曉勇 陸波 閔紅星 王毅 李軍

免疫組化等病理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中，為避免腦組織細(xì)胞的變形及自溶現(xiàn)象，動(dòng)物處死前需行灌注固定處理[1-2]，故動(dòng)物在體腦組織的灌注固定效果對試驗(yàn)結(jié)果尤為重要。就腦組織灌注固定方面，報(bào)道的文獻(xiàn)不少，有經(jīng)心臟灌注、頸總動(dòng)脈灌注、經(jīng)股動(dòng)脈灌注等方法；灌注過程中有夾閉腹主動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈等；灌注針有用靜脈輸液器針、自制灌流針（去掉輸液器針頭的針尖或12-16號(hào)針頭上套一長約1.5 cm的塑料管并將塑料管前端剪成針尖狀）和普通針頭等。對此，為尋求一種操作簡單易行且灌注固定效果好的方法，筆者在大鼠體腦組織的灌注固定實(shí)驗(yàn)過程中，采用動(dòng)脈留置針夾閉胸主動(dòng)脈經(jīng)心臟灌注的方法，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)操作過程的體會(huì)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和器械 BD動(dòng)脈留置針（貨號(hào)：REF682245，規(guī)格型號(hào)：20 G、1.10 mm× 45 mm、49 mL/min），見圖1，4%多聚甲醛新鮮配置（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），0.9%復(fù)方氯化鈉注射液（500 mL/4.5 g、寧夏啟元藥業(yè)），10%水合氯醛（成都金山化學(xué)試劑有限公司），三通（舒爾康、批號(hào)：120225）、止血鉗、組織剪、眼科剪、小動(dòng)脈夾、皮鑷、輸液管（2副）等。

圖1 BD動(dòng)脈留置針

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體重450~500 g，健康雄性18個(gè)月齡SD大鼠24只[購于寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（寧）2011-0001]，常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自由飲水，普通飲食。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將灌注所用的0.9%復(fù)方氯化鈉注射液加熱至37 ℃[3]、新鮮配置4%多聚甲醛濾去雜質(zhì)[3]、輸液管（兩副輸液管用三通連接好）、手術(shù)器械等物品準(zhǔn)備就緒后，放置盛有上述0.9%復(fù)方氯化鈉和4%多聚甲醛的輸液瓶距離操作臺(tái)1.5 m高的位置[4]。雄性SD大鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.4 mL/100 mg）麻醉，待大鼠反正反射消失后，將其仰臥位于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，固定頭部和四肢，暴露胸部，沿胸骨中線自劍突向上依次剪開皮膚和胸骨，充分暴露胸腔，顯露心臟和主動(dòng)脈弓，迅速用皮鑷提起左側(cè)肺，可見其下位于大鼠脊柱左側(cè)的胸主動(dòng)脈（ 胸主動(dòng)脈右側(cè)為食管）[5]，以小動(dòng)脈夾夾閉胸主動(dòng)脈。并迅速用眼科剪剪開心包，用動(dòng)脈留置針在心尖波動(dòng)最明顯處進(jìn)針，進(jìn)入約0.5 cm時(shí)，右手往外退針芯，同時(shí)左手持針翼將套管自左側(cè)心室推送至升主動(dòng)脈直至套管針尾部，此時(shí)，關(guān)閉套管針尾端的開關(guān)，防止血液外溢，連接輸液管，剪破右心耳，打開套管尾端和輸液管開關(guān)，灌注0.9%復(fù)方氯化鈉注射液，先快后慢，待自右心耳流出液體顏色清亮，此時(shí)旋轉(zhuǎn)三通開關(guān)，由快及慢灌注4%多聚甲醛，待大鼠頸部及上肢僵硬，說明灌注固定成功[6]。隨后斷頭取腦，之后將腦組織置于4%多聚甲醛固定4 ℃保存[7]。

1.4 觀察指標(biāo) （1）觀察并記錄灌注后大鼠組織的色澤、質(zhì)感及是否含有血絲。（2）觀察并記錄實(shí)驗(yàn)中所用的0.9%復(fù)方氯化鈉注射液和4%多聚甲醛的量、灌注插管時(shí)間、總灌注時(shí)間。灌注插管時(shí)間是指從針進(jìn)入心尖開始至插管成功所用時(shí)間，總灌注時(shí)間是從針進(jìn)入心尖開始至灌注固定成功所用時(shí)間。（3）觀察并記錄灌注過程中大鼠頸部、胡須、四肢和尾巴是否抽搐。（4）觀察并記錄灌注過程中是否發(fā)生肺循環(huán)灌注。發(fā)生肺循環(huán)途徑灌注的現(xiàn)象時(shí)鼻腔中會(huì)有灌流液流出[8]。（5）觀察并記錄在灌注插管過程中損傷血管、穿破心腔和灌注過程中套管脫出等不良事件的發(fā)生率。

2 結(jié)果

灌注后大鼠腦組織呈乳白色，質(zhì)地較硬，且未含血絲（圖2）。實(shí)驗(yàn)中所用的0.9%復(fù)方氯化鈉注射液和4%多聚甲醛的量分別為（107±9.2）mL、（175±17.3）mL，灌注插管時(shí)間和總灌注時(shí)間分別為（10±1.8）s、（41±4.1）min。灌注過程中大鼠頸部、胡須、上肢明顯抽搐，下肢及尾巴未抽搐。灌注過程中均未發(fā)現(xiàn)大鼠鼻腔中有灌流液流出，故未發(fā)生肺循環(huán)灌注。灌注插管過程中未出現(xiàn)損傷血管、穿破心腔和灌注過程中套管脫出等不良事件。

圖2 灌注后大鼠腦組織

3 討論

免疫組化等病理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中需對組織進(jìn)行定性、定位或定量研究。因此，在組織切片之前，需對組織進(jìn)行灌注固定，因?yàn)楣潭ê玫慕M織能抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的釋放和活性， 防止自溶；抑制組織中細(xì)菌的繁殖，防止組織腐敗，使細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂肪、糖等各種成分凝固成不溶性物質(zhì)，以防止物質(zhì)擴(kuò)散，維持原有組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)[9]。大鼠在體腦灌注過程中，通過大鼠天然的循環(huán)系統(tǒng)直接進(jìn)行灌注固定，固定液可快速、均勻地分布到腦組織各個(gè)部位，所以腦組織標(biāo)本制備多采用此法[10-11]。

灌注固定主要堅(jiān)持兩個(gè)原則：一要盡量保持活體的狀態(tài)；二要盡量行動(dòng)迅速從而避免動(dòng)物長時(shí)間處于痛苦和瀕死狀態(tài)，引起病理假象，從而干擾科研結(jié)果[12]。目前，據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，小動(dòng)物灌注多采用經(jīng)心臟灌注方法，而經(jīng)頸總動(dòng)脈因操作難度大，費(fèi)時(shí)而逐漸被淘汰。腦組織灌注過程中為節(jié)省灌注液，依研究報(bào)道有夾閉腹主動(dòng)脈、胸主動(dòng)脈等[5]，但夾閉腹主動(dòng)脈需進(jìn)行開腹，增加操作難度，延長灌注總時(shí)間，降低實(shí)驗(yàn)效率。灌注針是保證整個(gè)灌注過程的必要條件，因此，灌注針的選擇對整個(gè)灌注過程尤為重要。有研究報(bào)道灌注針可用靜脈輸液器針[8]、自制灌流針[5，13-14]和普通針頭[14]等，這些灌注針雖可進(jìn)行灌注，但都有各自弊端。如靜脈輸液器針和普通針頭因針尖鋒利，在插管過程中可刺破心臟及心室，且易脫出，使灌注失敗或發(fā)生肺循環(huán)灌注。而自制的灌流針[5，13]，一般因針尖鈍圓，不易刺入心臟，需借助眼科剪[12]，又因心臟跳動(dòng)，增加眼科剪的操作難度，在心尖處剪的口可能過大或過小，也可能剪破心臟，影響灌注固定效果，而通過剪口，插入灌注針，動(dòng)作要輕慢[5]，從而延長灌注時(shí)間甚至導(dǎo)致灌注失敗。陳浩宇等[14]自制的灌注針因塑料前端成針尖狀，在灌注插管時(shí)可損傷血管及心腔，并可能引起肺循環(huán)灌注。

因此，筆者采用動(dòng)脈留置針夾閉胸主動(dòng)脈經(jīng)心臟灌注的方法，可避免上述弊端，且依據(jù)許曉泉等[15]研究，在灌注開始時(shí)加熱至37 ℃的0.9%復(fù)方氯化鈉注射液的速度要快，能更好地排出腦組織內(nèi)的血流，灌注新鮮配置濾去雜質(zhì)的4%多聚甲醛時(shí)速度需放慢，讓多聚甲醛在腦組織內(nèi)停留更長的時(shí)間，以便有效固定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：灌注過程中大鼠頸部、胡須、上肢明顯抽搐，下肢及尾巴未抽搐，說明完全夾閉胸主動(dòng)脈，可節(jié)省灌注液；另外，灌注過程中未發(fā)生肺循環(huán)灌注，保證了體循環(huán)灌注的效果，進(jìn)而灌注后大鼠腦組織呈乳白色，未見血絲，且質(zhì)地較硬；灌注插管時(shí)間僅用了（10±1.8）s，可見操作簡單且節(jié)約時(shí)間；灌注插管過程中未出現(xiàn)損傷血管、穿破心腔和灌注過程中套管針脫出等不良事件，保證了灌注過程順利進(jìn)行，且可節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)：采用動(dòng)脈留置針為灌注針，在整個(gè)灌注過程中，發(fā)現(xiàn)采用動(dòng)脈留置針具有以下優(yōu)勢：（1）進(jìn)針易：動(dòng)脈留置針芯針尖鋒利，心尖處進(jìn)針容易，進(jìn)針約0.5 cm時(shí)退出針芯，將套管從左心室順利推送至升主動(dòng)脈，可節(jié)約灌注插管時(shí)間；（2）出血少：動(dòng)脈留置針套管的外徑較針芯大[16]，可完全占據(jù)心尖穿刺點(diǎn)，減少出血；（3）損傷?。涸谕顺鲠樞就扑吞坠苓^程中，由于套管頂端鈍圓，可避免損傷心腔及升主動(dòng)脈；（4）推送順：動(dòng)脈留置針套管原料采用聚四氟乙烯，管壁硬度適宜、光滑，可順利推送至升主動(dòng)脈；（5）明插管：在動(dòng)脈套管推送過程中，可看到套管進(jìn)入升主動(dòng)脈的全過程，確保插管成功，同時(shí)可避免肺循環(huán)灌注的發(fā)生；（6）易固定：套管尾端兩側(cè)有針翼，較其他灌注針容易固定；（7）難脫出：動(dòng)脈套管長度45 mm，插管成果后，套管很難脫出，有利于灌注的順利進(jìn)行；（8）速度可：動(dòng)脈留置針套管管腔直徑1.10 mm，流量49 mL/min，可保證灌注速度，強(qiáng)化灌注效果，節(jié)約灌注時(shí)間和灌注液。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)操作簡單，灌注插管迅速、損傷小，可避免肺循環(huán)灌注，總個(gè)灌注過程省時(shí)、省液，且灌注固定效果好，值得推廣應(yīng)用。

[1]季正劍，張冬霞，張立波，等.大鼠在體腦組織灌流方法的比較[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2009，29（6）：390-392.

[2]郭林芝，李靈敏. 大鼠腦組織石蠟切片免疫組化的體會(huì)[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44（4）：311-312.

[3]劉乃慧，張莉，邵穎，等. 在體心臟灌流術(shù)在大鼠腦組織切片觀察中的應(yīng)用[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2005，22（2）：52-53.

[4]高永強(qiáng)，楊巧蓮，王偉.大鼠局灶性腦缺血模型制備及取腦方法實(shí)驗(yàn)研究[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（4） ： 6-9.

[5]盧文朋，栗世方.大鼠腦組織灌注固定方法的改進(jìn)[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2014，27（6）：627-629.

[6]李晶晶，朱鴻，施彩虹.三種方法對大鼠視網(wǎng)膜固定效果的比較研究[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，31（8）：1105-1107.

[7] Stoltenberg M，Danscher G，Pamphlett R，et al.Histochemical tracing of bismuth in testis from rats exposed intraperitoneally to bismuth subnitrate[J].Reproductive Toxicology，2000，14（14）：65-71.

[8]王章敬，李煌元.靜脈輸液器應(yīng)用在小鼠體腦組織灌注方法[J].微量元素與健康研究，2014，31（1）：9.

[9]陳廣斌，謝玲，林堅(jiān)濤.不同固定方法對新生大鼠腦組織切片的影響[J].中國民康醫(yī)學(xué)，2008，20（15）：1730-1731.

[10]陳玉璽，王曉莉，牟青杰，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2013，26（6）：564-567.

[11]李丹，王志萍，宗劍，等.富氫液聯(lián)合淺低溫對大鼠腦缺血再灌注海馬氧化應(yīng)激水平的影響[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2012，25（1）：26-30.

[12]周傳龍，方劍喬，邵曉梅.大動(dòng)物灌注固定方法的探討[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2010，27（1）：70-71.

[13]劉海燕.灌注固定大鼠的技術(shù)操作及常見問題[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（11）：1341.

[14]陳浩宇，高亞兵，彭瑞云，等.一種改進(jìn)的大鼠腦組織灌注固定方法[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26（3）：208-212.

[15]許曉泉，劉圣，祖慶泉，等. 在體腦灌流技術(shù)在犬腦梗死實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用[J].江蘇醫(yī)藥，2011，37（20）：2357-2359.

[16]蔡云亮，潘春杰，王新，等. 動(dòng)脈留置針頸內(nèi)靜脈直接穿刺置管在休克搶救中的應(yīng)用[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，32（3）：386-388.