張巍

(美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院人類(lèi)和分子遺傳系，美國(guó)休斯頓 77030)

單基因病不簡(jiǎn)單：?jiǎn)位蜻z傳病的基因診斷技術(shù)進(jìn)展及展望

張巍

(美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院人類(lèi)和分子遺傳系，美國(guó)休斯頓 77030)

張巍博士(美國(guó)臨床分子遺傳學(xué)、臨床生化遺傳學(xué)、線(xiàn)粒體疾病和臨床高通量測(cè)序?qū)＜?。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)院專(zhuān)家委員(FACMG)，是美國(guó)少數(shù)擁有美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)(ABMG)雙專(zhuān)科執(zhí)照認(rèn)證的診斷醫(yī)生。1996年畢業(yè)于天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，2003年在萊斯(Rice)大學(xué)獲生化博士學(xué)位，2008年埃默里大學(xué)(Emory)和貝勒(Baylor)醫(yī)學(xué)院從事臨床基因診斷訓(xùn)練。原任美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室副主任、貝勒醫(yī)學(xué)院助理教授，現(xiàn)任貝勒醫(yī)學(xué)院客座副教授和廣州嘉檢醫(yī)學(xué)主任。

常年從事一線(xiàn)臨床基因診斷工作，重點(diǎn)開(kāi)發(fā)臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室的新一代工作流程及大數(shù)據(jù)分析算法。他的文章范圍包括從蛋白質(zhì)功能分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定、遺傳變異特性、以及大規(guī)模測(cè)序的臨床應(yīng)用等。他目前的工作重點(diǎn)是通過(guò)研究遺傳變異在人類(lèi)基因組中的基因型與臨床表型的相關(guān)性，為臨床醫(yī)生提供相應(yīng)的遺傳基因檢測(cè)結(jié)果和咨詢(xún)。以上研究成果共計(jì)發(fā)表SCI論文50余篇，并參于編寫(xiě)學(xué)術(shù)專(zhuān)著7部，被多次受邀在國(guó)際國(guó)內(nèi)學(xué)術(shù)大會(huì)上做專(zhuān)題報(bào)告。

臨床、科研和教育培訓(xùn)興趣包括先天性代謝疾病、染色體異常和出生缺陷遺傳病的基因?qū)W基礎(chǔ)、出生缺陷、產(chǎn)前診斷和新生兒篩查、遺傳咨詢(xún)和臨床管理、干預(yù)出生缺陷的公共衛(wèi)生策略。普及臨床醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)知識(shí)，講授臨床醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)的基本知識(shí)、新方法和新技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用，內(nèi)容覆蓋細(xì)胞遺傳、分子遺傳、代謝性疾病、線(xiàn)粒體疾病、新生兒篩查、遺傳咨詢(xún)和生物信息學(xué)等。

1 單基因病的簡(jiǎn)介和背景

當(dāng)一種疾病是由致病機(jī)制明確的某一個(gè)人類(lèi)基因缺陷而出現(xiàn)臨床癥狀和體征表現(xiàn)，我們一般稱(chēng)它為單基因疾病(single gene disorders)或符合孟德?tīng)栠z傳方式的疾病(Mendelian inheritance disorders)?，F(xiàn)在我們知道的已經(jīng)有明確致病機(jī)制的人類(lèi)基因疾病是大約7000多種，相應(yīng)來(lái)說(shuō)對(duì)于某一個(gè)單基因疾病的發(fā)病率是非常低的。如何在流行病學(xué)上定義一個(gè)疾病是不是罕見(jiàn)病，國(guó)際上不同國(guó)家也有不一樣的定義。例如，根據(jù)美國(guó)2002年制訂的罕見(jiàn)病法案，比較清楚地給出按疾病發(fā)病率的定義是，在美國(guó)3億人口中，如果一種疾病影響到20萬(wàn)人以下，也就是對(duì)某個(gè)病種如果在1500人中就有一個(gè)這樣的病人，這個(gè)疾病就可以認(rèn)為是一種罕見(jiàn)病。日本和歐洲也有類(lèi)似的疾病發(fā)病率的定義，大約是1/2000～1/2500左右。如果把這幾千種單基因疾病的發(fā)病率累加起來(lái)，單基因疾病的整體發(fā)病率為2%～3%，占我國(guó)的每年新增出生缺陷90萬(wàn)例(出生缺陷率根據(jù)《中國(guó)出生缺陷防治報(bào)告2012》的估計(jì)是5.6%)的很大比重。

一般來(lái)講，一個(gè)明確的單基因疾病在全國(guó)范圍內(nèi)是少見(jiàn)的，但在某個(gè)地區(qū)是有可能比較多發(fā)的。中國(guó)南方常見(jiàn)的蠶豆病是由在X染色體上的編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6PD基因的缺陷造成的，地中海貧血可以由在16號(hào)染色體的編碼alpha珠蛋白HBA基因或11號(hào)染色體的編碼beta珠蛋白HBB基因的缺陷造成。美國(guó)常見(jiàn)的單基因疾病是囊性纖維化，這是由在7號(hào)染色體的編碼囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子CFTR基因的缺陷造成的。單基因疾病常見(jiàn)的遺傳方式是常染色體隱形遺傳、常染色體顯性遺傳、X染色體連鎖遺傳，但是還有非常多的一部分單基因疾病是以比較復(fù)雜的遺傳方式出現(xiàn)，比如自發(fā)性的突變 (de novo)、銘印缺損(imprinting defect)、重復(fù)擴(kuò)張突變類(lèi)(repeatexpansion)等。

2 單基因病的臨床異質(zhì)性

單基因病的臨床異質(zhì)性是指當(dāng)一個(gè)基因的缺陷可以導(dǎo)致不同種類(lèi)的臨床表型，影響病人的基因突變的基因型和臨床癥狀相關(guān)性不明確，會(huì)對(duì)醫(yī)生和患者造成極大的診斷不確定性。在美國(guó)及歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家，由于生化和串聯(lián)質(zhì)譜的臨床應(yīng)用以及新生兒篩查工作的大規(guī)模開(kāi)展，對(duì)于一些遺傳代謝性疾病會(huì)有靈敏度高的遺傳代謝產(chǎn)物的生成，會(huì)對(duì)這一類(lèi)代謝性單基因疾病有直接臨床指導(dǎo)意義[1]。但是大部分的單基因病缺乏這種異常代謝產(chǎn)物和基因型的關(guān)系，也為臨床醫(yī)生在診斷和治療方面提出了極大的挑戰(zhàn)。例如，以DNA聚合酶γ亞單位(POLG)基因突變相關(guān)性的疾病就可以歸納出多種臨床癥狀，如進(jìn)行性眼外肌麻痹、Alpers綜合征、帕金森癥狀、少年脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、癲癇綜合征等[2，3]。電壓控鈉離子通道(SCN4A)基因突變相關(guān)性的疾病也可以多種臨床形式表現(xiàn)出來(lái)，如低血鉀性周期性麻痹、高血鉀性周期性麻痹、鉀離子相關(guān)性周期性癱瘓、先天性副肌強(qiáng)直、微管聚集性肌病、先天性肌無(wú)力綜合征[4，5]。然而，對(duì)于這些臨床表現(xiàn)已經(jīng)很復(fù)雜的單基因病，新的臨床癥狀和表型還是被不斷地發(fā)現(xiàn)，而同一個(gè)突變?cè)谝粋€(gè)家庭的不同成員或不同家庭間也會(huì)存在一些臨床癥狀的差異性。這也更進(jìn)一步說(shuō)明單基因病的復(fù)雜性和環(huán)境因素對(duì)癥狀的影響作用。所以，由于病人的癥狀的復(fù)雜性，能否準(zhǔn)確確定疾病的基因缺陷也是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。我們通常學(xué)習(xí)的醫(yī)學(xué)教科書(shū)往往只提供一種疾病的典型臨床癥狀，而在臨床實(shí)踐中每個(gè)單基因疾病都有可能是具有挑戰(zhàn)性的，這是由于疾病的變化和進(jìn)展，使得多數(shù)病人的臨床癥狀是非典型的表現(xiàn)。隨著高通量測(cè)序在臨床的廣泛應(yīng)用，一方面可以發(fā)現(xiàn)人類(lèi)新的致病基因，而更多方面是對(duì)已知的單基因疾病的非典型臨床癥狀或新的臨床癥狀的做進(jìn)一步理解。對(duì)于以前已經(jīng)有清楚認(rèn)知的單基因疾病，由于出現(xiàn)許多新的表型，表型擴(kuò)展的現(xiàn)象(phenotype expansion)也正變得越來(lái)越普遍，同時(shí)這些新的發(fā)現(xiàn)也會(huì)逐漸加強(qiáng)我們對(duì)個(gè)體疾病的準(zhǔn)確認(rèn)知[6]。

3 同一類(lèi)疾病的基因異質(zhì)性

像影響遺傳代謝性病的糖原合成及分解的糖原貯積病(glycogen storage diseases)，患者的初期臨床表現(xiàn)通常是間歇期酮癥性低血糖，一部分可以有肝功能異常，包括肝酶異常、肝腫大等，另外一部分患者有異常肌肉功能的表現(xiàn)，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)不耐受、肌肉無(wú)力和痙攣等。依靠明確的分子診斷是病人個(gè)性化管理和治療的關(guān)鍵，但是之前需要依賴(lài)創(chuàng)傷性的肝臟或肌肉活檢進(jìn)行生化方法和免疫組化檢測(cè)和診斷，在臨床上會(huì)有一定的局限性和不確定性，現(xiàn)已知有16個(gè)以上的基因是與糖原貯積病的癥狀有關(guān)。如果用傳統(tǒng)的一代測(cè)序(Sanger測(cè)序)的方法進(jìn)行分子診斷，將很難全面地對(duì)患者進(jìn)行分析，有可能造成漏診或誤診。最近的臨床研究表明，如果選用合理的高通量測(cè)序方案，輔以嚴(yán)格的臨床檢測(cè)流程，可以達(dá)到65%的臨床確診率[7]。

遺傳性神經(jīng)肌肉疾病也是遺傳異質(zhì)性相當(dāng)高的一系列疾病，雖然臨床可以分成不同的亞型，包括先天性肌病、肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、CMT病、代謝肌病、肌強(qiáng)直綜合征和離子通道疾病等。雖然以神經(jīng)源性和肌源性系統(tǒng)受影響的程度和部位不同，初期臨床表現(xiàn)多以肌無(wú)力、強(qiáng)直、萎縮或疼痛等癥狀出現(xiàn)，但遺傳性神經(jīng)肌肉疾病可以有幾百種相關(guān)基因。最近的臨床研究對(duì)236個(gè)神經(jīng)肌肉疾病相關(guān)的基因進(jìn)行臨床級(jí)別的檢測(cè)，可以達(dá)到83%的確診率[8]。

具有表型明確的單基因性孟德?tīng)柤膊?，由于診斷技術(shù)的進(jìn)步，之前認(rèn)為是疑難病癥的疾病，現(xiàn)在也可以相對(duì)容易地根據(jù)已知臨床癥狀，縮小分子診斷的范圍，為患者和醫(yī)生提供非常寶貴的最初的診斷線(xiàn)索[9]。

4 基因突變譜的異質(zhì)性

一種單基因疾病的臨床表型不但隨著病情的發(fā)生階段而不同，而且也與引起疾病基因的突變類(lèi)型有關(guān)。通常來(lái)講由于拷貝數(shù)變異引起基因組致病的結(jié)構(gòu)性變化的是與常染色體顯性遺傳或X連鎖性遺傳病有關(guān)，而與單基因相關(guān)的疾病常常是常染色體隱性遺傳方式表現(xiàn)。致病性的基因突變類(lèi)型大致可以包括，有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸變化的點(diǎn)突變(SNV)或多個(gè)核苷酸的變化引起較大區(qū)域的拷貝數(shù)突變(CNV)。以常見(jiàn)的侏儒畸形之一軟骨發(fā)育不全為例，雖然大部分的突變是新生的，但是FGFR3基因的同樣c.1138G>A (p.Gly380Arg)點(diǎn)突變占了98%以上的病例。這是一類(lèi)以點(diǎn)突變?yōu)橹鞯膯位蚣膊?。而以假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(DMD)，也稱(chēng)Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，約65%的基因突變是引起較大的區(qū)域(至少一個(gè)外顯子)缺失和重復(fù)突變，其余的約35%是點(diǎn)突變[10]。由于在同一個(gè)基因因?yàn)橥蛔冾?lèi)型造成臨床表征不同的比較典型的疾病是成骨不全又稱(chēng)為脆骨癥(osteogenesis imperfecta，OI)，這個(gè)疾病是由COL1A1基因的編碼的αI型膠原缺陷導(dǎo)致的全身性結(jié)締組織和相應(yīng)骨骼的病變。當(dāng)患者有COL1A1基因無(wú)義突變(nonsense)時(shí)的骨骼表現(xiàn)比病人有錯(cuò)義突變(missense)臨床癥狀輕微[11]。對(duì)于一個(gè)單基因的疾病，臨床醫(yī)生不但需要熟知這個(gè)疾病的不同臨床癥狀表現(xiàn)對(duì)病人進(jìn)行治療和處理，也需要了解引起這個(gè)疾病基因的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的突變譜。為了獲得一個(gè)單基因病的基因的完整突變信息，可以采取分步檢測(cè)和排除的方式，只有這樣才能提高檢測(cè)的陽(yáng)性率，同時(shí)為病人減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在目前來(lái)講，可能有一個(gè)相對(duì)全面的分子診斷項(xiàng)目可以同時(shí)進(jìn)行點(diǎn)突變和拷貝數(shù)變異的檢測(cè)[12]。

5 單基因病的基因診斷技術(shù)進(jìn)展及展望

已經(jīng)在我國(guó)進(jìn)行新生兒篩查的氨基酸代謝的病苯丙酮尿癥，通常認(rèn)為是由于苯丙氨酸羥化酶(PAH)的缺陷引起的單基因病，但是有關(guān)四氫生物蝶呤(BH4)的缺陷也會(huì)引起苯丙酮尿癥。這樣總共是有6個(gè)基因可以引起這一個(gè)疾病。當(dāng)一代測(cè)序剛普及的時(shí)候，對(duì)這6個(gè)基因的進(jìn)行測(cè)序是非常昂貴的，一個(gè)PAH基因檢測(cè)陰性而氨基酸代謝產(chǎn)物陽(yáng)性的患者是沒(méi)有能力進(jìn)行全部余下基因檢測(cè)的。隨著全基因組芯片和高通量測(cè)序在臨床分子診斷領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，我們可以對(duì)幾十到20 000個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，而且這些技術(shù)對(duì)人類(lèi)新基因發(fā)現(xiàn)也是非常有價(jià)值的[13,14]。由于臨床的需要和這些技術(shù)的獨(dú)特性，這些新的診斷技術(shù)在美國(guó)臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室得以廣泛應(yīng)用。一方面是滿(mǎn)足個(gè)性化醫(yī)學(xué)的臨床診斷的要求，另一方面也為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供準(zhǔn)確的基因組學(xué)的信息[15]。

但是這些新技術(shù)無(wú)疑也會(huì)有相應(yīng)的不足之處，以雜交捕獲方法為例，因?yàn)槟承┗蚪M區(qū)域的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成不同，不少關(guān)鍵基因的測(cè)序覆蓋程度不均勻或是沒(méi)有覆蓋，這種情況會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性。在假基因和同源性很高的基因組區(qū)域，會(huì)有異常的高覆蓋情況，也會(huì)容易引起結(jié)果的假陽(yáng)性[16]。另外測(cè)序化學(xué)相關(guān)的錯(cuò)誤和分析算法的偏差也需要在臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行考慮[17]。建立一個(gè)滿(mǎn)足“臨床標(biāo)準(zhǔn)”工作流程和相應(yīng)的算法是一個(gè)非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，最近的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有開(kāi)放源碼的生物信息學(xué)分析軟件包對(duì)于變異的低符合率也要引起我們足夠的警覺(jué)[18]，所以了解每個(gè)環(huán)節(jié)的局限性無(wú)疑是有助于幫助病人和醫(yī)生做出正確的選擇。

在臨床基因診斷工作中，我們目睹了分子診斷的快速發(fā)展，基因組技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)可以把每個(gè)人的全基因組測(cè)序成為可能。新的高通量技術(shù)已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室的科研工具變成臨床診斷的主要工具，可以提高診斷率，減少所需的時(shí)間和成本，以疾病表型為主的基因檢測(cè)項(xiàng)目和全基因組測(cè)序的會(huì)更加普及應(yīng)用，也為精準(zhǔn)醫(yī)療發(fā)展奠定了基礎(chǔ)[6]。

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編輯：劉鄧浩

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中國(guó)產(chǎn)前診斷雜志(電子版)編輯部

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2015-09-21)