張旭濤++孟瑾++張峰

[摘要] 目的 探討生長抑制因子5（ING5）抑制肺癌細胞增殖的作用。 方法 采用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法建立A549細胞ING5高表達細胞系A(chǔ)549-ING5-OE和A549細胞空質(zhì)粒對照細胞系A(chǔ)549-control。采用細胞增殖實驗和克隆形成實驗觀察ING5過表達對肺癌A549細胞增殖能力的影響；采用皮下接種方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察ING5對裸鼠皮下成瘤能力及腫瘤體積大小的影響。 結(jié)果 本實驗成功構(gòu)建了肺癌A549-ING5過表達細胞系，與A549-control比較，細胞系A(chǔ)549-ING5-OE中ING5表達顯著增高；增殖實驗結(jié)果顯示ING5高表達顯著抑制了肺癌細胞的增殖能力；克隆形成實驗結(jié)果顯示細胞系A(chǔ)549-ING5-OE中ING5高表達的肺癌細胞克隆形成能力明顯低于A549-control肺癌細胞（P < 0.01）；裸鼠在體水平研究結(jié)果顯示ING5高表達可以抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長。 結(jié)論 ING5可以抑制肺癌細胞的增殖，為臨床治療肺癌提供新的治療靶點。

[關(guān)鍵詞] 肺癌細胞；生長抑制因子5；增殖；克隆形成；裸鼠成瘤

[中圖分類號] R734 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）02（a）-0004-04

肺癌的發(fā)生是個涉及多基因改變的復(fù)雜過程，其中癌基因的激活和抑癌基因的失活是兩大關(guān)鍵要素。生長抑制因子（inhibitor of growth，ING）作為候選抑癌基因家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要抑制作用[1]，目前已發(fā)現(xiàn)5個成員，包括ING1、ING2、ING3、ING4、ING5[2]。ING編碼的蛋白在結(jié)構(gòu)上具有相似性，功能上存在共同的作用，ING蛋白參與磷脂酰肌醇介導(dǎo)的脂類信號通路及激素介導(dǎo)的通路，抑制細胞生長，誘導(dǎo)細胞凋亡和DNA損傷修復(fù)[3-7]，同時ING蛋白也具有各自的特點[8-13]。在多種腫瘤中ING家族基因的表達均下調(diào)[7]，已有的研究表明，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中ING1、ING2、ING4均起到重要作用[14-15]。ING5作為家族的最新成員于2003年被首次報道。2006年Cote課題組[16]研究揭示ING5參與構(gòu)成兩種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）復(fù)合體，并且能與組蛋白結(jié)合而作為連接HAT與組蛋白的橋梁分子參與組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)，表明ING5可通過輔助HAT表觀調(diào)控基因表達而發(fā)揮抑癌作用。ING5與臨床腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究表明，61%的原發(fā)口腔腫瘤組織中ING5 mRNA水平降低，31例中有3例檢測到ING5基因發(fā)生突變；在肝癌組織中ING5 mRNA表達量下降，起到抑癌基因的作用[17]；在食管鱗癌組織中ING5 mRNA的表達量同樣下降[18]。進一步研究表明ING5可與P53相互作用，并促進P53轉(zhuǎn)錄活化，而引起結(jié)腸癌細胞周期阻滯和凋亡[19]。但ING5在肺癌中的作用尚未見報道，本實驗擬建立ING5高表達肺癌細胞株，采用細胞增殖、克隆形成及裸鼠皮下荷瘤模型探討ING5對肺癌細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞（中科院上海細胞庫），GV218載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、細胞裂解液均購自西安碧云天科技生物有限公司，蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche，G418購自美國Gibco，細胞培養(yǎng)液DMEM高糖、胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購自美國HyClone，青鏈霉素混合液購自北京Solarbio，ING5抗體購自美國Proteintech，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Advansta，兔二抗購自英國Abcam，電子游標(biāo)卡尺購自哈爾濱量具刃具有限責(zé)任公司，4%多聚甲醛購自西安科昊生物技術(shù)有限公司，裸鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)（以下簡稱“我?！保嶒瀯游镏行奶峁?/p>

1.2 GV218慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建A549-ING5-OE和A549-control細胞系

含ING5 cDNA的慢病毒載體和對照載體為吉凱公司構(gòu)建。用胰蛋白酶消化液消化293T細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為6×105個/mL，接種于細胞培養(yǎng)皿，待細胞密度達80%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h將培養(yǎng)液換成無血清培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入293T細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)8 h后棄掉含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞，加入10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。48 h后收集293T細胞上清液，1000 r/min離心除去細胞碎片，收集上清即為病毒顆粒濃縮液。對數(shù)生長期A549細胞，培養(yǎng)液中加入病毒顆粒濃縮液進行感染，12 h后觀察細胞狀態(tài)，沒有明顯的細胞毒副作用，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換新的培養(yǎng)液，感染3 d后觀察GFP基因的的表達。感染后A549細胞計數(shù)，調(diào)整密度為300個/孔，接種至6孔板，用G418篩選，藥物濃度為5 μg/mL，每隔24 h更換新的培養(yǎng)液，篩選3 d后，用熒光顯微鏡觀察細胞克隆，挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)，直至獲得需要的細胞量。

1.3 Western blot檢測ING5在A549-control和A549-ING5-OE細胞中的表達

收集對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞在冰上裂解30 min，細胞裂解液為150 mmol/L NaCl、1%NP-40、0.5% 去氧膽酸、0.1%SDS、50 mmol/L Tris（pH 8.0），蛋白酶抑制劑（1∶25），裂解后高速離心20 min，收集上清即為細胞總蛋白，蛋白定量試劑盒定量。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制10%的凝膠。電泳，樣品在濃縮膠電壓100 V，20 min，在分離膠電壓120 V繼續(xù)電泳。轉(zhuǎn)膜，電壓55 V，210 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用麗春紅染液染色，PBST脫色。牛奶封閉1 h，一抗ING5（1∶1000）封閉4℃過夜。PBST洗3次，每次5 min，二抗封閉1 h，PBST洗3次，每次5 min。用增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒（Amersham Bioscience）檢測蛋白的表達。

1.4 檢測ING5對肺癌細胞增殖的抑制

將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞用胰蛋白酶消化液消化，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×104個/孔，接種至24孔板，兩種細胞各種4個復(fù)孔，每孔加1 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。從細胞貼壁開始計時24、48、72、96 h后各計數(shù)1次。

1.5 檢測ING5對肺癌細胞克隆形成能力的抑制

將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞用胰蛋白酶消化液消化，計數(shù)，調(diào)整細胞密度為300個/孔，接種至6孔板，每孔加2 mL 10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液。細胞接種5 d后每孔各加500 μL胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。貼壁生長15 d后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，PBS輕輕沖洗細胞，室溫風(fēng)干后計數(shù)多于50個細胞的克隆。根據(jù)公式計算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/300×100%。

1.6 ING5抑制裸鼠皮下成瘤實驗

出生4周雄性裸鼠，對照組和實驗組各7只隨機分組，由第四軍醫(yī)大學(xué)（以下簡稱“我校”）實驗動物中心代養(yǎng)。裸鼠適應(yīng)7 d后，將對數(shù)生長期A549-control和A549-ING5-OE細胞用胰蛋白酶消化液消化，計數(shù)，調(diào)整密度為每只裸鼠5×106個/200 μL，混勻在無血清DMEM培養(yǎng)液，分別接種至對照組和實驗組裸鼠皮下。7 d后裸鼠皮下成瘤，每隔3 d用電子游標(biāo)卡尺測1次移植瘤長徑（a）和短徑（b），并計算腫瘤體積（V）：ab2/2，繪制腫瘤生長曲線。裸鼠實驗遵循我校關(guān)于動物保護和做好動物福利規(guī)定，并經(jīng)我校實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測ING5蛋白表達

為了檢測ING5是否在所轉(zhuǎn)染細胞中高表達，將A549-control和ING5高表達細胞對數(shù)生長期時用細胞裂解液提取總蛋白，Western blot結(jié)果顯示與A549-control相比，ING5在A549-ING5-OE細胞中表達量顯著增高。見圖1。

圖1 ING5在A549-ING5-OE細胞中的表達情況

2.2 ING5抑制肺癌細胞增殖

顯微鏡下觀察可見A549-control和A549-ING5-OE細胞生長良好，緊密排列，形態(tài)為梭形，細胞之間形成連接。A549-ING5-OE細胞的增殖速度明顯低于A549-control細胞，增殖速度為A549-control的一半，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖2。

與A549-control比較，**P < 0.01

圖2 A549-control與A549-ING5-OE細胞增殖曲線

2.3 ING5抑制肺癌細胞克隆形成能力

A549-control和A549-ING5-OE細胞接種在6孔板15 d后，計數(shù)細胞數(shù)多于50個的克隆，結(jié)果表明與A549-control相比ING5高表達肺癌細胞的克隆形成能力明顯降低，A549-ING5-OE細胞的克隆形成率為A549-control細胞的50%，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

2.4 ING5抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長

裸鼠皮下接種A549-control和A549-ING5-OE細胞，7 d后成瘤，隨著時間的增加，接種A549-control裸鼠腫瘤生長較快，接種A549-ING5-OE的裸鼠腫瘤生長明顯較慢，結(jié)果表明ING5高表達后顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長。見圖4。

圖4 生長抑制因子5抑制裸鼠皮下種植瘤的生長

2.5 接種A549-ING5-OE及A549-control細胞后大鼠體積變化情況

接種A549-ING5-OE細胞成瘤，腫瘤體積大小基本無增加。A549-control細胞接種成瘤，腫瘤體積明顯增大。從腫瘤生長曲線可以看出ING5高表達的肺癌細胞腫瘤生長明顯被抑制，腫瘤體積較對裸鼠A549-control細胞接種顯著減小。見圖5。

圖5 腫瘤生長曲線

3 討論

作為候選抑癌基因家族成員，近年來ING家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機制受到越來越多的關(guān)注。路美玲等[17]研究結(jié)果表明，與正常肝組織相比，肝癌細胞株ING5 mRNA表達明顯降低，在腫瘤轉(zhuǎn)化過程中與正常組織相比ING5表達明顯被抑制。趙春陽等[18]研究結(jié)果表明，在腫瘤細胞中ING5表達水平越低，腫瘤的惡性程度就越高。

研究表明，肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲、轉(zhuǎn)移是多基因參與、多步驟發(fā)生的過程[19-20]。隨著近年來外科技術(shù)發(fā)展的日趨完善，新的化學(xué)治療藥物和局部治療方法不斷出現(xiàn)，但對肺癌的總體治療效果卻不甚理想，因此從分子水平研究肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機制，針對肺癌中異常分子的治療藥物和治療方法就成了新的研究熱點，并促進了肺癌分子靶向治療的出現(xiàn)。本研究中，通過慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法使ING5在A549細胞中高表達，發(fā)現(xiàn)ING5高表達后與對照肺癌細胞相比，其增殖能力和克隆形成能力均降低，說明在細胞水平ING5抑制了肺癌細胞的增殖和克隆形成能力。通過裸鼠在體水平的研究同樣發(fā)現(xiàn)，ING5抑制了裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長，動物實驗研究結(jié)果同樣說明ING5抑制了肺癌細胞的增殖，與上述細胞實驗結(jié)果相符。

綜上所述，ING5在肺癌細胞高表達后抑制了肺癌細胞的增殖，提示ING5在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到了抑癌基因的作用，為肺癌的基因治療提供了新的靶點。

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（收稿日期：2014-11-14 本文編輯：任 念）